GPX4、ACSL4及LPCAT3在结直肠癌细胞模型放疗抵抗中的作用机制研究

【摘要】 目的  分析谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4 ，GPX4）、长链酯酰辅酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（lysophospholipid acyltransferase 3，LPCAT3）在结直肠癌细胞模型放疗抵抗中的作用。  方法  研究起止时间为2022.7-2024.6，制备三维纤维蛋白软胶与肿瘤细胞悬液，经实时荧光定量核酸扩增检测系统检测DNA浓度，GPX4、ACSL4及LPCAT3的表达经免疫印迹实验检测，使用流式细胞仪检测脂质过氧化水平，对比control细胞和肿瘤再生细胞存活率和克隆形成率、GPX4、ACSL4和LPCAT3的表达水平、铁死亡诱导剂和X－放射线照射处理后细胞脂质过氧化水平，分析control细胞和肿瘤再生细胞抵抗表达情况。 结果  肿瘤再生细胞存活率和克隆形成率更高，对比差异显著（P＜0.05）；与control细胞比较，肿瘤再生细胞GPX4、LPCAT3表达水平更高，ACSL4表达水平更低（P＜0.05）；肿瘤再生细胞经铁死亡诱导剂和X－放射线照射处理后，脂质过氧化相对荧光强度稍微上升，与处理前比较无差异（P＞0.05）；control细胞铁死亡诱导剂和X－放射线照射处理后，脂质过氧化相对荧光强度高于处理前（P＜0.05）。 结论  结直肠细胞可能通过GPX4、LPCAT3高表达、ACSL4低表达抵抗铁死亡，进而抵抗放疗。

【关键词】谷胱甘肽过氧化物酶4；长链酯酰辅酶A合成酶4；溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶；3；结直肠癌细胞；铁死亡；放疗抵抗

结直肠癌为消化道恶性肿瘤，其发生率上升趋势明显，严重影响现代人健康。放疗为疾病常用治疗方式，但它在治疗疾病的同时也会推动肿瘤进一步发展，作为应激压力，放疗有筛选肿瘤的作用，可杀灭无法耐受该疗法的肿瘤细胞，耐受性好的细胞可继续存活，并生长繁殖。放疗过程中，肿瘤对身体内环境的变化适应性不断增强，可出现放疗抵抗。它是一种基因、因子和机制互相影响、共同作用引起的复杂结果，细胞周期阻滞、内微环境变化和基因改变等均与放疗抵抗密切相关，降低患者生存率[1-2]。肿瘤干细胞具有永生和自我更新能力，数目相对恒定，浸润与转移能力相对较强，是引发恶性肿瘤，推动其发展进程，导致其复发转移的影响因素之一，正常情况下，其“自我更新”和“分化”间有着明确界限，自我更新过快便可增加恶性肿瘤风险。此外，它对恶性肿瘤治疗有抵抗特性，接受放疗时先杀死非肿瘤干细胞，而此类细胞因其抵抗性而残余，继续分化形成肿瘤细胞，动作放疗抵抗，是放疗抵抗发生发展的重要参与者，但受鉴定方式局限性和微环境异质性的影响，目前未能明确其防御特征与作用机理[3]。因此，应对细胞模型进行优化，深入研究放疗抵抗，对现有治疗方案予以改进，提高结直肠癌患者放疗效果。现阶段，临床在结直肠癌放疗抵抗的相关研究中取得进展，逐渐发现铁死亡与放疗抵抗的关联，这一概念于2012年被提出，它是一种新型细胞死亡方式，可被调节，属于代谢性细胞死亡，与退行性疾病、癌症和缺血再灌注损伤等病变相关，其在结直肠癌放疗抵抗中涉及多种蛋白异常表达[4-5]。谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4 ，GPX4）、长链酯酰辅酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（lysophospholipid acyltransferase 3，LPCAT3）为铁细胞凋亡关键因子，可调控铁细胞凋亡。现三者在结直肠癌细胞模型放疗抵抗中的作用机制总结如下：

1  材料与方法

1.1  仪器与试剂

人结直肠癌细胞HCT116、培养基（双抗+胎牛血清）、聚偏二氟乙烯膜、化学发光试剂、实时荧光定量核酸扩增检测试剂盒、蛋白定量试剂盒、裂解液、缓冲液、预制蛋白胶、山羊抗兔（抗鼠）二抗、GPX4抗体、ACSL4抗体和LPCAT3抗体等。

1.2  方法

（1）细胞培养与三维纤维蛋白软胶的制备：用10%胎牛血清制成培养基，置于37℃、二氧化碳浓度为5%的培养箱中进行control细胞的培养，纤维蛋白原浓度和硬度对应值为1mg/mlVS90Pa，根据实验要求制作细胞混合液（纤维蛋白原+T7缓冲液），往培养板加入细胞混合液和凝血酶，0.5h后补充培养基，制作肿瘤再生细胞。（2）单细胞悬液制备：稀释溶胶酶，直至浓度达到2mg/ml，加入溶胶酶，静止至无固态凝胶，离心，去除上层清液，加入胰酶替代物，反复吹打，水浴5min，经显微镜观察，获得单细胞悬液。（3）实时荧光定量核酸扩增实验：分离并提取DNA，检测其浓度；溶液配置根据逆转录试剂盒说明书操作，设置反应程序，结果由相对定量算法计算得出。（4）细胞增殖检测：方法为MTS法，将两类细胞于96孔板接种，各孔800个细胞，48h后经X-放射线照射，置于培养箱培养48h，加入试剂，2h后经酶标仪检测光密度值，选择20个control细胞和肿瘤再生细胞进行后续实验。（5）免疫印迹实验：细胞培养24h后，分别用剂量为2、4、6、8 Gy的X-放射线照射，培养48h，收集单细胞悬液，稀释细胞，接种后，培养2周。观察细胞克隆情况，肉眼观察到克隆细胞时，停止培养；于培养板上接种细胞，72收集h后收集细胞，并进行蛋白定量检测；转移SDD-PAGE至聚偏二氟乙烯膜，于室温放置，封闭1h；TBST缓冲液进行3次冲洗后，将抗β-tublin、待测抗体以1：1000的比例稀释处理后依次加入，于4℃的条件下静置1夜；再次予以TBST缓冲液冲洗，共进行3次，对二抗进行稀释，比例为1:8000，加入培养板，常温下放置1h，按照上述操作继续冲洗，配置增强型化学发光试剂，继续冲洗，经软件计算并进行结果出来。（6）脂质过氧化水平：检测方法为流式细胞术，取出细胞，行（4Gy、8Gy）X-放射线和铁死亡诱导剂处理，缓冲液清洗3次，染色后孵育30min，缓冲液清洗3次，制备单细胞悬液，置于离心管进行时长为4min的离心处理，收集沉淀；使用400目网筛过滤细胞悬液，脂质过氧化水平经流式细胞仪测定。

1.3  观察指标

1.3.1  细胞培养结果

对crnotrol细胞和肿瘤再生细胞存活率（接种后细胞光度值占接种前的百分比）和克隆形成率（克隆形成试验计算）。

1.2.2  两组不同酶表达水平

比较放射剂量为2、4、6、8 Gy时，control细胞和肿瘤再生细胞GPX4、ACSL4和LPCAT3的表达水平。

1.3.3  脂质过氧化水平

比较铁死亡诱导剂和X-放射线照射（4Gy与8GY）处理后，control细胞和肿瘤再生细胞脂质过氧化相对荧光强度。

1.4  统计学方法

数据经软件SPSS 22.0处理，计量资料满足正态分布特征，x̄±s表示，两组对比经t检验，多组对比经单因素方差（F）检验，P＜0.05提示对比有差异。

2  结果

2.1  细胞培养结果

crnotrol细胞存活率和克隆形成率更低，对比差异显著（P＜0.05），见表1。

表1  细胞培养结果（x̄±s,%）

2.2   细胞酶表达水平对比

X-放射线剂量为2、4、6、8 Gy时，肿瘤再生细胞GPX4和LPCAT3表达水平更高，ACSL4表达水平更低，与control细胞对比有差异（P＜0.05），见表2。

表2  不同酶表达水平对比（x̄±s）

续表2  细胞酶表达水平对比（x̄±s）

2.3  脂质过氧化水平

肿瘤再生细胞处理前后脂质过氧化水平对比一致（P＞0.05）；control细胞处理后指标水平上升，对比差异显著（P＜0.05），见表3。

表3  脂质过氧化水平（x̄±s）

3  讨论

放疗是中晚期结直肠癌患者常用的治疗方式，但其效果一般，仅有少部分患者对此方案敏感，甚至有患者存在放疗抵抗，需分析其原因和分子机制，以优化治疗方案，改善预后。

通常情况下培养于三维纤维蛋白软胶（硬度为90Pa）的肿瘤再生细胞致癌性强，可推动癌细胞形成与转移[6]。本研究按照同样的方式制备细胞并进行对比，结果显示，肿瘤再生细胞存活率和克隆形成率更高（P＜0.05），提示前者细胞增殖能力强，对放疗损害有抵抗作用。

铁死亡为非凋亡性细胞坏死，对铁离子浓度依赖性明显，其主要特征为活性氧堆积，与细胞凋亡与坏死有着明显区别，以谷胱甘肽耗竭，过氧化物酶活性下降、脂质氧化物代谢异常为本质，可诱导活性氧产生，诱导铁死亡。其特点为：线粒体缩小，外膜破裂、密度上升，同时伴随活性氧上升和相关基因突变，对肿瘤细胞对放疗的抵抗有刺激作用[7-8]。GPX4为GPX家族成员，其组成为170个氨基酸，是细胞生存的关键，可调控铁死亡，对脂质过氧化物有降解作用，可清除膜脂过氧化物，在谷胱甘肽作用下还原过氧化脂质为脂醇，促使细胞抵抗铁死亡，其水平下调，可增加对铁死亡的敏感性；肿瘤细胞中，该因子高表达，可负向调控铁死亡，引起放疗抵抗[9-10]。ACSL4可转化游离脂肪酸为脂酰辅助酶A，诱导铁死亡，此时予以放疗，可提高其表达水平，促进产物生成，增加铁死亡风险，因此，可通过下调ACSL4水平对GPX4诱导的细胞凋亡有抑制作用[11]。LPCAT3主要分布于细胞内质网、高尔基体及脂滴，也可存在于细胞核和细胞膜上，促进辅助酶A酯化，与脂质代谢密切相关，可导致脂质代谢失调，引起脂质过氧化与铁死亡[12]。本研究对比显示，肿瘤再生细胞ACSL4和LPCAT3表达量更高，ACSL4表达量明显低于control细胞；经铁死亡诱导剂处理后，control细胞脂质过氧化水平明显高于处理前和X-放射线照射（P＜0.05），表明肿瘤再生细胞对铁死亡有抵抗作用。

本研究经细胞模型分析CSL4、ACSL4和LPCAT3在结直肠癌放疗抵抗中的作用机制，存在几处不足：（1）样本量少，研究结论可推广性不明；（2）对铁死亡抵抗放疗的分子机制研究较为浅显；之后的研究中，可增加样本数量，对相关机制展开更为深入的研究。

综上所述，本研究制作肿瘤再生细胞模型，对放疗抵抗机制进行探讨，发现其通过CSL4和LPCAT3高表达和ACSL4低表达抵抗铁死亡，进而在放疗抵抗中发挥作用，可为铁死亡诱导疗法的应用奠定基础，为该方案临床转化提供参考依据。

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本研究为江西省卫生健康委科技计划立项课题，编号：202311992.

作者简介：赖海平（1983-2），性别：男，民族：汉，学历：本科，职称：副主任医师，现就职单位：赣州市肿瘤医院，研究方向：从事肿瘤疾病诊疗工作。身份证号码：362130198302014111