基于报告基因法检测地舒单抗注射液生物学活性研究

摘要：本研究旨在利用报告基因法建立并测定地舒单抗注射液的生物学活性。方法：通过RANKL蛋白刺激HEK293-RANK-nanoLuc细胞产生荧光，同时使用抗RANKL单克隆抗体（地舒单抗注射液；KN012）抑制该反应，且其抑制效果与抗体用量呈线性关系，以此测定其生物学活性。此外，我们对细胞代次的稳定性以及不同浓度的KN012和RANKL蛋白的作用进行了研究。最后，参照2020版《中华人民共和国药典》四部通则9101的分析方法，对其专属性、相对准确度、精密度、线性、范围、不同细胞代次耐用性、不同细胞孵育时间耐用性、不同供试品孵育时间耐用性以及不同Nano-Glo® Luciferase Assay显色时间耐用性进行了方法学验证。结果：成功建立了报告基因法检测KN012生物学活性的方法。随着KN012浓度的增加，细胞的Luminescence信号值显著降低，表明KN012具有明显的浓度抑制效应。通过150%、130%、100%、80%、60%的五个浓度点进行线性和准确性验证，实测与理论效价的线性回归分析相关系数为R²=0.9714，不同效价水平的相对效价测定值的相对偏倚在±15%范围内；日内、日间的精密度以及不同人员之间的重复性相对效价测定值的几何变异系数均小于20%。此外，不同细胞代次、孵育时间、供试品孵育时间及不同Nano-Glo® Luciferase Assay显色时间的效价测定值相对偏倚均在±15%范围内，符合检测要求。结论：建立的报告基因法检测KN012生物学活性的方法适用性强，可应用于质量控制和放行检测中。

关键词：地舒单抗注射液；报告基因法；生物学活性；方法学验证

中图分类号：R45

引言

RANKL又名为TNF相关激活诱导细胞因子（TNF-related activation-induced cytokine，TRANCE）、骨保护素配体（osteoprotegerin ligand,OPGL）、破骨细胞分化因子（osteoclastdifferentiation factor,ODF）[1]。RANKL在人体中以跨膜或可溶性蛋白两种形式存在，两种形式均可以与受体RANK结合并传递信号，一方面可以促进破骨细胞前体细胞（Osteoclastprecursor cell, OPC）向破骨细胞分化，另一方面，可以维持破骨细胞的存活和功能[2-3]。RANKL/RANK信号增强可以导致破骨细胞数量增多、功能增强，骨吸收增加。因此，RANK/RANKL信号通路在破骨细胞成熟过程中起着重要作用。如果RANKL与受体RANK结合，而不是与诱饵受体骨保护素（OPG）结合，会激活下游NF-kB通路，促进破骨细胞的存活和增值，导致骨的再吸收[4]。进而引起骨质疏松和其他骨相关的疾病，这使RANK/RANKL成为药物开发有价值的靶点。

地舒单抗是一种针对RANKL的特异性单克隆抗体药物，能够以高亲和力和高特异性结合RANKL，进而中和并阻断RANKL与RANK之间的相互作用。这一机制有效地抑制了相关信号通路的生物学功能，从而降低了成骨前体细胞（OPC）的数量和活性[5]。通过这些作用，地舒单抗能够显著降低骨丢失的速度，恢复骨代谢平衡，增加骨密度和骨骼强度，从而预防骨折的发生。生物抗体类药物的特点在于其较高的分子量、复杂的结构和显著的异质性；即使是微小的结构改变，也可能对药物的质量和活性产生影响。根据国际协调会议（ICH）Q6B指南，生物抗体类药物的质量评估不仅需要对其物理和化学性质进行检测，生物学活性同样是重要的质量指标[6]。

抗体药物的活性分析主要通过体外检测，包括基于细胞、转基因细胞和新技术（如ELISA、Biacore等）的多种方法进行[7]。值得一提的是，报告基因检测系统，主要以荧光素为底物测定荧光素酶活性的方法，同时也可以用于评估抗体类药物的生物学活性[8]。该方法实验窗口大、响应值高，并且有利于药品的长期稳定性检测和方法验证等[9]。在本实验中，将含有编码RANK和荧光素酶的质粒导入HEK293细胞中，以构建HEK293-RANK-nanoLuc细胞株，作为活性检测细胞株。当RANKL识别并结合RANK受体时，激活荧光素酶信号通路，从而启动荧光素酶的表达。地舒单抗注射液能特异性与RANKL结合，并阻断RANKL与RANK的结合，进而抑制荧光素酶的表达。因此，可以通过测定荧光强度来评估地舒单抗注射液的生物学活性。

1 仪器与试剂

微孔板检测系统SpectraMax iD3购自美谷分子仪器（上海）有限公司，自动细胞计数仪IC1000购自南京润研生物科技有限公司，二氧化碳细胞培养箱（气套红外）BC-J160购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，倒置生物显微镜XDS-1B购自上光（苏州）仪器有限公司，Puromycin购自Gibco，DMEM购自Gibco，FBS购自Gibco，Hygromycin B购自Invitrogen，Recombinant Human RANKL / OPGL / TNFSF11 / CD254 Protein购自Sino Biological Inc，Nano-Glo® Luciferase Assay购自Promega。生长培养基（DMEM+10% FBS+50mg/ml Hygromycin B+ Purmycin dihydrochloride）自配，实验培养基（DMEM+10% FBS）自配。地舒单抗注射液参考品（编号：KN012-PS-211112；KN012）由本公司生产。

2 方法与结果

2.1 HEK293-RANK-Luc细胞株的构建

通过电转法将pNL（Nluc/NFkB/Hygro）Vector，pCDNA（RANK/Puromycin）Vector在HEK293细胞过表达，经抗生素筛选，通过有限稀释法得到过表达亚克隆细胞株HEK293-RANK-nanoLuc，该细胞株均由上海甲贝医药科技有限公司构建并转移至本实验室。

2.2 KN012抑制HEK293-RANK-nanoLuc细胞RANKL/RANK信号通路研究

将构建好的HEK293-RANK-nanoLuc细胞消化后，用实验培养基将细胞重悬，密度调整至2×105 cells/mL，50 μL/孔加入至96孔白板中，置于37℃、5% CO2培养箱中过夜培养。第二天利用实验培养基将Recombinant Human RANKL（RANKL蛋白）稀释至0.12 μg/mL，将地舒单抗注射液参考品（编号：KN012-PS-211112；KN012）稀释至4.8 μg /mL，先三倍稀释三个点，再四倍稀释三个点，再三倍稀释三个点，共十个稀释梯度，25 μL/孔加入至96孔白板中，继续培养5-6 h，细胞板平衡后每孔加入100 μL Nano-Glo® Luciferase Assay，温避光放置10分钟，置于微孔板检测系统上检测发光（Luminescence）信号值。结果如图所示，随着KN012浓度的增加，细胞的Luminescence信号值显著降低，表明KN012有明显的浓度抑制相应。

2.3 细胞代次稳定性研究

将HEK293-RANK-nanoLuc细胞连续传代培养至P5、P15和P30代冻存，复苏不同代次的细胞继续传代一次，胰酶进行消化后，用实验培养基重悬调整至50 μL/孔加入至96孔白板中，置于37℃、5% CO2培养箱中过夜培养。第二天利用实验培养基将RANKL蛋白稀释至10 μg/mL，4倍梯度稀释11个浓度点，50 μL/孔加入至96孔白板中，继续培养5-6 h，细胞板平衡后每孔加入100 μL Nano-Glo® Luciferase Assay，温避光放置10分钟，置于微孔板检测系统上检测发光（Luminescence）信号值。结果如图所示，可以看出P5、P15、P30不同代次的细胞生物学曲线相似，信号无明显变化，窗口值接近，符合实验需求，且EC50值接近。

2.4 不同浓度KN012和RANKL蛋白作用的比较

参考2.2的方法将细胞消化、铺板和过夜培养，第二天后分别将KN012样品稀释成1.2 µg/mL和4.8µg/mL起始工作浓度，之后进行1：2.5梯度稀释，从第一个孔取出100 µL加入到150 µL Assay Medium中混匀，按照此方式依次稀释11个点，共11个浓度点。在96孔板中每孔加入25 µL稀释好的KN012与靶细胞混合，每个浓度梯度点做两个复孔。随后在96孔板中每孔分别加入25 µL稀释好的RANKL蛋白（工作浓度0.03 µg/mL和0.12 µg/mL）混合均匀后，继续培养5-6 h，细胞板平衡后每孔加入100 μL Nano-Glo® Luciferase Assay，温避光放置10分钟，置于微孔板检测系统上检测发光（Luminescence）信号值。结果如图所示，不同工作浓度的KN012均能抑制RANKL对HEK293-RANK-Luc的激活，为了节约蛋白，将KN012起始工作浓度定为1.2 µg/mL，RANKL蛋白工作浓度定为0.03 µg/mL应用于后续实验研究。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性

用实验培养基稀释KN012参考品、KN012原液Buffer、SNA001参比品，使反应起始为1.2 μg/mL，2.5倍进行梯度稀释，稀释11个浓度梯度，检测各样品的生物学活性。结果如表1所示，KN012参考品有明显生物学活性，并且呈现较好的四参数量效曲线均近似于S型，且出现明显上下平台，拟合度R2＞0.95，KN012原液Buffer、SNA001参比品无明显生物学活性，表明该方法专属性良好。

2.5.2 相对准确度

用实验培养基将KN012参考品稀释成5个效价水平（150%、130%、100%、80%、60%），测定每个效价水平下的EC50，以KN012参考品为对照，计算150%、130%、100%、80%、60%的相对效价，相对效价= EC50（参考品）/ EC50（供试品）×100%，每个效价水平由2名分析人员在不同日期，使用4个细胞代次进行相对效价测定，每个效价水平独立测定2次，每次以两份结果的几何平均值作为报告值。以效价理论值的对数(横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作线性回归。计算不同效价水平测定值的相对偏倚（RB），RB=(效价测量值/效价理论值－1)×100%。结果如图1和表2、3所示，每个不同效价水平相对效价测定值的相对偏倚为-2.1%～4.5%，在±15%范围内；直线回归方程y=0.9401x+0.0088，斜率为0.9350，在0.8～1.2范围内。表明该方法的相对准确度良好。

2.5.3 精密度

用实验培养基将KN012参考品稀释成5个效价水平（150%、130%、100%、80%、60%），由2名分析人员，4个代次细胞，不同日期，每个效价水平独立测定2次，测定每个效价水平下的EC50，以参比品为对照，计算150%、130%、100%、80%、60%的相对效价。计算每个效价水平相对效价测定值的几何标准偏差（GSD）、几何变异系数（GCV，%）。结果如表4所示，每个不同效价水平相对效价测定值的几何变异系数（GCV，%）为4.2%～ 7.9%，均小于20%。表明仪器的精密度较为准确。

2.5.4 线性

方法同2.2.3。以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作图，采用最小二乘法进行线性回归。结果如图1所示，数据引用表2，拟合的直线回归方程为y=0.9401x+0.0088：R2为0.9714。表明该方法的线性良好。

2.5.5 范围

根据相对准确度、中间精密度和线性符合要求时的相对效价水平，确定范围区间。结果表明本方法中的相对准确度、精密度和线性均符合要求的效价水平范围为60%～150%，涵盖了其质量标准（80%～130%）的范围。

2.5.6 不同细胞代次耐用性

用实验培养基将KN012参考品稀释成5个效价水平（150%、130%、100%、80%、60%），分别用4个不同代次的细胞进行实验，每个效价水平独立测定2份，以参考品为对照，测定每个效价水平下的EC50；计算每个效价水平的相对活性，每次以两份结果的几何平均值作为报告值。结果如表5所示，不同细胞代次的5个不同效价水平效价测定值相对偏倚为-6.4%～3.5%，均在±15%范围内。表明该细胞在活性功能方面具有一定的稳定性。

2.5.7 不同细胞孵育时间耐用性

用实验培养基将KN012参考品稀释成5个效价水平（150%、130%、100%、80%、60%），细胞孵育时间分别为12小时、15小时、18小时进行实验，每个条件每个效价水平独立测定2份，以参比品为对照，测定方法同2.5.6。结果如表6所示，不同细胞孵育时间的5个不同效价水平效价测定值相对偏倚为-1.5%～6.3%，均在±15%范围内。

2.5.8 不同供试品孵育时间耐用性

用实验培养基将KN012参考品稀释成5个效价水平（150%、130%、100%、80%、60%），供试品孵育时间分别为5小时、6小时进行实验，每个条件每个效价水平独立测定2份，以参比品为对照，测定方法同2.5.6。结果如表7所示，6.6.4.3 不同供试品孵育时间的5个不同效价水平效价测定值相对偏倚2.7%～8.2%均在±15%范围内。

2.5.9 不同Nano-Glo® Luciferase Assay显色时间耐用性

用实验培养基将KN012参考品稀释成5个效价水平（150%、130%、100%、80%、60%），Nano-Glo® Luciferase Assay显色时间分别为5min、10min 、15min 、20min进行检测，以参比品为对照，测定方法同2.5.6。结果如表8所示，不同Nano-Glo® Luciferase Assay显色时间的5个不同效价水平效价测定值相对偏倚-10.0%～1.1%均在±15%范围内。

图1 细胞株RANKL/RANK信号通路验证结果

FIG. 1 Verification results of RANKL/RANK signaling pathway in cell lines

图2 HEK293-RANK-nanoLuc细胞株P5、P10、P30代次稳定性研究结果

FIG. 2 The substability of HEK293-RANK-nanoLuc cell lines P5, P10 and P30

图3 不同浓度KN012和RANKL蛋白作用的比较研究结果

FIG. 3 Comparative study results of the effects of KN012 and RANKL proteins at different concentrations

表1 专属性实验结果

Table 1 Specific experimental results

表2 相对准确度验证结果

Table 2 Relative accuracy verification results

图4 直线回归方程

FIG. 2 Linear regression equation

表3 不同效价水平相对效价测定值的相对偏倚

Table 3 The relative bias of titer measurements at different titer levels

表4 精密度不同活性水平测定值的几何标准差、几何变异系数及置信上限

Table 4 Geometric standard deviation, coefficient of geometric variation and upper confidence limit of measured values with different activity levels of precision

表5 耐用性不同细胞代次验证结果

Table 5 Verification results of different cell generations for durability

表6 耐用性不同细胞孵育时间验证结果

Table 6 Results of durability verification for different incubation times of cells

表7 耐用性不同供试品孵育验证结果

Table 7 Results of incubation verification of different test products for durability

表8 耐用性不同显色时间验证结果

Table 8 Verification results of durability with different color development times

讨论

近年来，生物抗体类药物在临床应用中越来越普遍。由于其分子结构的异质性，质量控制不仅需要检验其理化性质，还需评估其生物活性。目前，抗体类药物的生物活性检测方法包括基于动物的体内生物学活性测定、生化分析法和基于细胞的生物活性测定等[10]。随着3R原则的推广，基于细胞的报告基因法因其操作简便、周期短、成本低、高通量和变异度小等优点，正在逐步取代基于动物的生物活性检测方法[11]。目前，在2020年版《中国药典》中明确采用报告基因法的药物主要为I型干扰素和重组人白细胞介素-2，其他如促红素、FSH等仍处于研究或方法推广阶段[12-14]。随着技术发展，报告基因法在药典中的应用范围有望进一步扩展，抗体类药物也可能逐步纳入标准检测体系。

在先前的研究表明竞争性ELISA可以测定抗RANKL单克隆抗体的生物活性。然而，ELISA仅仅涉及RANKL单克隆抗体与RANK结合的初始步骤，距离生物反应的终点还远远不足，因此它不能完全代表抗RANKL单克隆抗体的药物作用机制[15]。猪瓣膜间质细胞（PBMCs）也可以用于测定抗RANKL单克隆抗体的生物活性，通过培养和刺激猪瓣膜间质细胞，可以评估抗RANKL单抗的作用，从而判断其抑制RANKL的生物活性[16]。在体内实验中，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性检测是一种常用检测药物活性的方法，其用于评估破骨细胞的成熟状态[17]。TRAP是一种特异性标志物，主要用于识别和检测成熟破骨细胞。通常会提取患者或小鼠来源的破骨细胞，并进行TRAP染色，通过与抗RANKL单克隆抗体药物的结合，可以用于评估破骨细胞的数量，还能反映其活性和功能[18]。但整个生物测定需要五到七天的时间，因此该生物测定不适用于抗RANKL单克隆抗体的释放。有报道称，基于RAW264.7细胞的RANKL诱导的NF-κB驱动荧光素酶检测可以反映RANKL的生物活性，就像同种细胞中TRAP活性反映的破骨细胞生成检测一样[19]。然而，这种简单的检测方法只应用于RANKL的研究领域，却从未建立、优化或验证过它是否适合用于测量抗RANKL单克隆抗体的生物活性。目前Chuanfei Yu[20]等人将NF-κB驱动的荧光素酶报告基因载体转入到高表达RANKL的RAW264.7细胞株，首次建立了检测抗RANKL单克隆抗体生物学活性的报告基因法。因此在本实验中，我们选择了高效转染和表达外源基因的细胞HEK293细胞系，通过电转法将pNL（Nluc/NFkB/Hygro）Vector，pCDNA（RANK/Puromycin）Vector在HEK293细胞过表达，经抗生素筛选，通过有限稀释法得到过表达亚克隆细胞株HEK293-RANK-nanoLuc。该方法具有良好的检测性能，如特异性、线性、精密度和准确度，适用于抗RANKL单克隆抗体的生物活性测定。这一方法的成功应用，为抗RANKL单克隆抗体的生物活性测定提供一种可靠且有效的工具。它不仅可以用于抗体的基础研究，还可以用于指导企业的生产工艺研发及产品的质量控制。

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