罕见β-珠蛋白基因突变导致地中海贫血的研究

摘要 目的：研究地中海贫血中罕见β-珠蛋白基因突变的类型、血液学特征和临床表现。方法：选取深圳市前海蛇口自贸区医院2020年1月-2024年3月进行检测地中海贫血的病例。采用血细胞分析仪进行血常规检测，高效液相色谱法（HPLC）进行血红蛋白分析，PCR-电泳技术和PCR-反向斑点杂交技术进行α-地中海贫血基因分析，PCR-反向斑点杂交技术和高分辨率溶解曲线（HRM）进行β-地中海贫血基因分析，对怀疑罕见的β-地中海贫血进行Sanger测序。结果：发现有6例携带有罕见β-珠蛋白基因突变患者，突变位点分别是:-28(A＞C)、

CD81(CTC＞CTA)、IVSII-180(T＞C)、IVSII-738(A＞T)、IVSII-337(A＞G)、IVSII-462(C>T)，其中IVSII-738(A＞T)和IVSII-462(C＞T)为新发突变，临床表现为中度贫血。结论：对血液表型与基因型不符的疑似β-地中海贫血患者进行罕见β-珠蛋白基因分析，对指导β-地贫遗传咨询、产前诊断和降低危重β-地贫患儿的出生具有重要作用。

关键词：罕见，β-珠蛋白基因，突变，β-地中海贫血，Sanger测序。 

β-地中海贫血(β-地贫）是常染色体隐性遗传性疾病，主要由β-珠蛋白基因的单核苷酸突变导致，少数由缺失或插入引起，使β-珠蛋白肽链合成减少或缺失，产生的慢性溶血性贫血，临床表现为小细胞低色素性贫血[1]。在我国，地中海贫血多发生于长江以南地区，尤其以广西、广东和海南为高发[2-3]。目前已报道有400多种β-珠蛋白突变类型，其中以CD41-42(-TCTT)、IVS-II-654(C＞T)、-28(A＞G)、CD17(A＞T)为主。本文报道6种罕见β-珠蛋白基因-28(A＞C)、CD81(CTC>CTA)、IVSII-180(T＞C)、IVSII-738(A＞T)、IVSII-337(A＞G)、IVSII-462(C＞T)突变，其中IVSII-738(A＞T)和IVSII-462(C＞T)为新发突变，为临床诊疗和遗传咨询提供依据。

1.1研究对象

选取深圳市前海蛇口自贸区医院2020年1月-2024年3月进行检测地中海贫血的病例，常规检测β-地贫阴性但疑似β-地贫携带者病例进行罕见地贫检测。

1.2研究方法

1.2.1血液学检测

用含有EDTA-K2真空采血管采集患者外周静脉血2ml，用血细胞自动分析仪（XN90000，希森美康，日本）进行血常规检测，检测红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞平均血红蛋白量（MCH）等指标。

1.2.2 DNA提取

应用潮州凯普生物化学有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒（Hybribio Limited）从患者外周血中提取DNA。应用贝克曼分光光度计测定样本的浓度和纯度。

1.2.3β-地贫基因检测

利用PCR-反向斑点杂交技术和高分辨率溶解曲线（HRM）进行常见17个位点的19种HBB基因突变检测。对罕见的β-地贫基因突变类型进行Sanger测序，测序引物设计三对，它们分别是：

G1正向引物(β-FP）CGGCTGTCATCACGAAGACCT，G1反向引物(β-RP）CAGCTCACTCAGTGTGGCTTC；

G2正向引物(β-FP）GCTGTTATGTAGAACCCT，

G2反向引物(β-RP）TTGCTATTGCCTCGTCCCAGA；G3正向引物(β-FP）ATGTATCATCGATCTTTGCAC，G3反向引物(β-RP）GTTTTAAATACGCTGACCTCC。

反应总体系100ul，10uM的正反引物各5uL，提取的全血DNA 2uL，Taq DNA聚合酶2uL，10×buffer 10uL，5Q solution 20uL，25mM Mg2+3uL，25mM dNTPs 3uL，去离子水50uL。反应条件：95℃预热15min；94℃60s，68℃30s，72℃60s，共35个循环；72℃持续10min。使用ABI Veriti®96-Well Thermal Cycler仪器进行扩增。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为120V，15~30min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。用纯化试剂盒AMPLIQON PureIT ExoZAP PCR CleanUp、ABI ExoSAP-IT™PCR Product Cleanup和磁珠纯化提纯扩增产物，用3500xL Dx遗传分析仪进行测序，测序结果使用Bioedit软件分析。将测序序列与所对应的参考序列进行比对，如果观察到测序序列与参考序列不一致，使用ClinVar或ALAMUT数据库检查是否存在氨基酸改变。

2.结果

2.1一般资料

6例罕见β-地贫患者之间没有亲缘关系，年龄14-51岁，平均33岁，均为女性。面色苍白，皮肤巩膜无黄染，无输血史。

2.2血液学检测结果

6例患者的血液学检测结果均为小细胞低色素贫血，其中2例轻度贫血、1例中度贫血和3例重度贫血。MCV、MCH均降低，其中4例Hb≥3.5%、1例<2.5%，见表1。

2.3基因检测结果

6例患者均未检出常见17个位点的19种HBB基因突变。经HBB基因序列分析，发现为罕见β-地贫类型。突变位点分别是:-28(A＞C)、CD81(CTC＞CTA)、

IVSII-180(T＞C)、IVSII-738(A＞T)、IVSII-337(A＞G)、IVSII-462(C＞T)，其中IVSII-738(A>T)和IVSII-462(C＞T)为新发突变，临床表现为中度贫血。见图1。

3.讨论

β-地中海贫血多由β-珠蛋白基因簇的点突变引起，少数由大片段突变引起。β-珠蛋白基因簇位于11p15.5上，由3个外显子区和2个内含子区构成。世界范围内，在地中海、中东和亚洲后裔人群中，β-地中海贫血突变的患病率

最高。在中国，地中海贫血多发生于长江以南地区，尤其以广西、广东和海南为高发。根据临床和实验室检查结果将β地中海贫血分为三种类型。轻型β-地中海贫血(β-地贫)也称为携带者或特质型，是一种杂合子状态，通常无症状，表现为轻度贫血。β-地中海贫血突变的纯合子或复合杂合子导致更严重的贫血谱系，称为中间型β-地中海贫血和重型β-地中海贫血。这两者在临床上通过输血依赖来区分。

目前临床常规检出17个位点的19种HBB基因突变，占据中国人群β-地贫的97%以上，但仍有3%左右的罕见β-地贫患者和携带者被漏检[6]。而且这种漏检率随着人口的迁移，显得更为突出，它的突变谱也在不时发生变化[7]。对预防和治疗β-地贫带来一定的难度，容易误诊。文中提到的6例罕见β-珠蛋白基因突变患者中，携带有IVSII-738(A＞T)和IVSII-462(C＞T)的新发突变，临床需要输血来维持生命，给患者带来沉重的生活和心理负担。

本研究也首次鉴定出-28(A＞C)、CD81(CTC＞CTA)、IVSII-180(T＞C)、IVSII-738(A＞T)、IVSII-337(A＞G)和IVSII-462(C＞T)的β-珠蛋白基因突变。-28(A＞C)国际命名法（HGVS）HBB:c.-78A＞C，突变为β基因编码区上游78号碱基A突变为C，为致病性突变，临床表型为β+；CD81(CTC＞CTA)国际命名法（HGVS）HBB:c.246 C＞A，突变为β基因编码区序列的246号碱基C突变为A，未查到有明确致病性信息；IVSII-180(T＞C)国际命名法（HGVS）HBB:c.315+180T＞C，突变为β基因第二个内含子的180号碱基T突变为C，未查到有明确的临床表型；IVSII-738(A＞T)国际命名法（HGVS）HBB:c.316-113A＞T，突变为β基因第二个内含子的738号碱基A突变为T，数据库中未查到该突变位点；IVSII-337(A＞G)国际命名法（HG VS）HBB:c.315+337A＞G，突变为β基因第二个内含子的337号碱基A突变为G，临床表型为可能良性；IVSII-462(C＞T)国际命名法（HGVS）HBB:c.316-389C＞T，突变为β基因第二个内含子的462号碱基C突变为T，数据库中未查到该突变位点。

对血液表型与基因型不符的疑似β-地中海贫血患者进行罕见β-珠蛋白基

因分析，对指导β-地贫遗传咨询、产前诊断和降低危重β-地贫患儿的出生具有重要作用。

参考文献：

[1]Origa R.β-Thalassemia.Genet Med.2017 Jun;19(6):609-619.doi:10.1038/gim.2016.173.Epub 2016 Nov 3.PMID:27811859.

[2]Lai K,Huang G,Su L,He Y.The prevalence of thalassemia in mainland China:evidence from epidemiological surveys.Sci Rep.2017 Apr 19;7(1):920.doi:10.1038/s41598-017-00967-2.

PMID:28424478;PMCID:PMC5430438.

[3]Xian J,Wang Y,He J,Li S,He W,Ma X,Li Q.Molecular Epidemiology and Hematologic Characterization of Thalassemia in Guangdong Province,Southern China.Clin Appl Thromb Hemost.2022 Jan-Dec;28:10760296221119807.doi:10.1177/10760296221119807.PMID:

35979587;PMCID:PMC9393661.

[4]Ali S,Mumtaz S,Shakir HA,Khan M,Tahir HM,Mumtaz S,Mughal TA,Hassan A,Kazmi SAR,Sadia,Irfan M,Khan MA.Current status of beta-thalassemia and its treatment strategies.Mol Genet Genomic Med.2021 Dec;9(12):e1788.doi:10.1002/mgg3.1788.Epub 2021 Nov 5.PMID:34738740;PMCID:PMC8683628.

[5]Jalilian M,Azizi Jalilian F,Ahmadi L,Amini R,Esfehani H,Sosanian M,Rabbani B,Maleki

M,Mahdieh N.The Frequency of HBB Mutations Amongβ-Thalassemia Patients in Hamadan Province,Iran.Hemoglobin.2017 Jan;41(1):61-64.doi:10.1080/03630269.2017.1302468.Epub 2017 Apr 10.PMID:28391758.

[6]YaXuan Cao,JianMing Luo;Identification of two novelβ-globin gene mutations HBB:exon3del,HBB:c.-81A>C.Hematology(Amsterdam,Netherlands)2023 Dec;28(1):2265723 doi:10.1080/16078454.2023.2265723

[7]Rao E,Kumar Chandraker S,Misha Singh M,Kumar R.Global distribution ofβ-thalassemia mutations:An update.Gene.2024 Feb 20;896:148022.doi:10.1016/j.gene.2023.148022.Epub

2023 Nov 23.PMID:38007159.

基金项目：深圳市南山区科技计划项目（重点项目）

项目编号：NS2022006（重点）