血清Th1、Th2细胞因子在糖尿病肾病及非糖尿病肾病中的临床研究

【摘要】目的：探讨2型糖尿病肾病(DKD)、非糖尿病肾病(NDKD)及DKD合并NDKD患者血清Th1、Th2细胞因子的表达特点及临床意义。方法：选取2023年12月至2024年12月就诊的DKD患者26例(DKD组)、NDKD患者25例(NDKD组)和DKD合并NDKD患者20例(合并组)作为研究对象。采用微量样本多重蛋白定量技术(CBA)检测血清IFN-γ、TNF、IL-6、IL-10和IL-17A水平,同时检测空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、肌酐(Cr)等临床指标。结果：三组患者血清Th1/Th2细胞因子水平存在显著差异(P<0.05);DKD组IL-6、TNF水平显著高于NDKD组(P<0.05);合并组IL-10水平显著低于其他两组(P<0.05);血清IL-6、TNF与FPG、HbA1c呈正相关(P<0.05)。结论：血清Th1、Th2细胞因子在不同类型肾病中表达谱存在特异性差异,可为临床诊断和预后评估提供新的参考指标。

【关键词】糖尿病肾病; 非糖尿病肾病; Th1细胞; Th2细胞

糖尿病肾病(Diabetic Kidney Disease, DKD)是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)最常见和最严重的微血管并发症之一,是导致终末期肾病的主要原因。研究表明,约30%-40%的T2DM患者会发展为DKD。随着糖尿病发病率的不断升高,DKD的发病率也呈上升趋势。然而,糖尿病患者除了可能发生DKD外,还可能合并非糖尿病肾病(Non-diabetic Kidney Disease, NDKD),其发生率约为4%-45.5%。由于DKD、NDKD及两者并存时的发病机制、临床表现和预后均有所不同,准确鉴别诊断对于制定个体化治疗方案具有重要意义。免疫炎症反应在肾脏疾病发生发展中发挥重要作用。T辅助细胞(Helper T cell, Th)及其分泌的细胞因子参与多种肾脏疾病的病理过程。Th1细胞主要分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)等促炎因子,而Th2细胞则分泌白介素-4(IL-4)、IL-6、IL-10等具有免疫调节作用的细胞因子。此外,Th17细胞分泌的IL-17在自身免疫性疾病中也发挥重要作用[1]。目前研究发现,Th1/Th2失衡与DKD的发生发展密切相关,但在NDKD及DKD合并NDKD中的作用尚未明确。

微量样本多重蛋白定量技术(Cytometric Bead Array, CBA)是一种基于流式细胞术的新型多重蛋白检测方法,具有灵敏度高、重复性好、样本用量少等优点。本研究拟采用CBA技术检测DKD、NDKD及DKD合并NDKD患者血清Th1、Th2相关细胞因子水平,探讨其在不同类型肾病中的表达特点及临床意义,为疾病诊断和预后评估提供新的思路。

1对象与方法

1.1研究对象

选取2023年12月至2024年12月在我院肾内科就诊并经肾活检确诊的患者71例。其中DKD组26例(男14例,女12例),年龄53.41±8.32岁,病程11.37±3.63年;NDKD组25例(男13例,女12例),年龄52.82±8.13岁,病程12.21±3.13年;DKD合并NDKD组(合并组)20例(男11例,女9例),年龄54.12±9.11岁,病程12.65±4.03年。三组性别构成、年龄和病程比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准,所有受试者均签署知情同意书。纳入标准:(1)年龄18-70岁;(2)经肾活检明确病理诊断;(3)DKD组符合2020年中国2型糖尿病防治指南中DKD诊断标准;(4)NDKD组经病理确诊为非糖尿病所致肾病;(5)合并组同时具备DKD和NDKD的病理特征。排除标准:(1)1型糖尿病或其他特殊类型糖尿病;(2)已进展至慢性肾病5期或正在接受血液透析治疗;(3)肾脏疾病发病早于糖尿病确诊;(4)合并严重感染、心力衰竭等影响尿蛋白排泄的疾病;(5)合并恶性肿瘤、结缔组织病等免疫系统疾病;(6)妊娠期女性。

1.2研究方法

1.2.1 标本采集与处理

受试者入组后均在清晨空腹状态下进行标本采集。由经过培训的专业护士使用一次性真空采血管采集受试者肘静脉血8mL。采血前准备工作：检查采血管有效期，核对患者信息，做好标本标识。采血时，先使受试者取坐位，轻轻叩击肘部静脉，待血管充盈后，以75%酒精消毒穿刺部位皮肤，待酒精干后进行静脉穿刺。将采集的血液分装处理：取2mL全血加入含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管中，立即轻轻颠倒混匀8-10次，避免溶血，用于糖化血红蛋白的测定；剩余6mL血液置于无添加剂促凝管中，轻轻颠倒3-5次后，室温（20-25℃）静置30min使血液充分凝固。随后将促凝管置于台式离心机中，以3000r/min（离心半径15cm）离心10min。使用一次性移液管小心吸取上清透明血清，避免吸入红细胞和凝块。将分离的血清按0.5mL/管分装于冻存管中，并做好标记。分装后的血清标本立即置于-80℃超低温冰箱保存，用于后续细胞因子的检测，避免反复冻融。

1.2.2检测指标及方法

(1)常规实验室指标检测

采用日立7600全自动生化分析仪进行检测，空腹血糖(FPG)采用己糖激酶法，测定范围3.9-6.1mmol/L；血肌酐(Cr)采用苦味酸法，参考值44-133μmol/L；尿素氮(BUN)采用脲酶-谷氨酸脱氢酶法，参考值3.2-7.1mmol/L；尿酸(UA)采用尿酸酶法，参考值140-414μmol/L。糖化血红蛋白(HbA1c)采用Bio-Rad D-10型全自动糖化血红蛋白分析仪，利用高压液相色谱法检测，参考值4.0%-6.0%。超敏C反应蛋白(hs-CRP)采用免疫散射比浊法检测，使用贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪，检测范围0-10mg/L。所有检测均严格按照仪器操作规程和试剂说明书进行。

(2)血清细胞因子检测

采用BD公司人Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒，通过CBA技术在BD FACSCanto™ II流式细胞仪上进行检测。具体操作步骤：①将50μL标本或标准品与50μL捕获珠混合，室温避光孵育1h；②加入50μL PE标记的检测抗体，室温避光继续孵育2h；③加入1mL PBS洗涤液，1500rpm离心5min，弃上清；④加入300μL PBS重悬，上流式细胞仪检测；⑤使用FCAP Array v3.0软件分析数据，根据标准曲线计算样本中细胞因子的浓度。每批次检测均设立质控品，确保结果准确可靠。

1.3 统计学方法  

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。正态分布计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验;非正态分布计量资料以中位数(四分位数间距)[M(QR)]表示,组间比较采用Kruskal-Wallis H检验;计数资料以例数(%)表示,组间比较采用χ2检验;相关性分析采用Pearson或Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1三组患者一般资料和实验室指标比较

三组患者性别构成、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。DKD组和合并组FPG、HbA1c水平显著高于NDKD组(P<0.05);三组Cr、BUN、UA水平比较差异无统计学意义(P>0.05);DKD组和合并组hs-CRP水平显著高于NDKD组(P<0.05)(表1)。

表1 三组患者一般资料和实验室指标比较(x±s)

2.2三组患者血清细胞因子水平比较

DKD组TNF、IL-6水平显著高于NDKD组(P<0.05);合并组IL-10水平显著低于其他两组(P<0.05);三组IFN-γ和IL-17A水平比较差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 三组患者血清细胞因子水平比较[M(QR),pg/mL]

2.3血清细胞因子水平与临床指标的相关性分析

Spearman相关分析显示,血清TNF、IL-6水平与FPG、HbA1c和hs-CRP呈显著正相关(P<0.05);IL-10水平与FPG、HbA1c呈负相关(P<0.05)(表3)。

表3 血清细胞因子水平与临床指标的相关性(r值)

3讨论

DKD是糖尿病最常见的微血管并发症,其发病机制复杂,涉及代谢异常、氧化应激和免疫炎症等多个方面。NDKD可与DKD并存,增加了临床诊治的难度。近年研究表明，免疫炎症在DKD的发病过程中发挥核心作用，其中Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子失衡可能是疾病进展的关键环节。然而，目前对于DKD合并NDKD时细胞因子的变化特点及其临床意义研究较少。本研究首次采用CBA技术同时检测并比较了DKD、NDKD及两者并存患者血清中Th1、Th2相关细胞因子的表达水平，发现不同类型肾病患者的细胞因子谱存在特异性差异[2]。这些差异不仅反映了疾病的免疫炎症特点，也为临床诊断和预后评估提供了新的思路。本研究首次采用CBA技术同时检测DKD、NDKD及DKD合并NDKD患者血清Th1、Th2相关细胞因子水平,为深入理解疾病发病机制提供了新的视角。近年来研究表明，免疫炎症反应在DKD发病过程中起着核心作用，Th1/Th2失衡可能是疾病进展的关键环节[3]。本研究采用CBA技术进行细胞因子检测，较传统ELISA方法具有更高的灵敏度和重复性，可同时检测多种细胞因子，为深入研究免疫炎症机制提供了可靠的技术支持。

本研究发现,DKD组和合并组患者血清TNF、IL-6水平显著高于NDKD组。TNF是一种重要的促炎因子,可激活核转录因子-κB(NF-κB)通路,诱导炎症因子的表达,促进肾小球基底膜增厚和细胞外基质沉积[4]。研究表明，TNF还可通过以下途径加重肾脏损伤：①诱导足细胞凋亡，破坏滤过屏障完整性；②上调黏附分子表达，促进炎症细胞浸润；③激活MAPK通路，促进纤维化进程；④增加氧化应激，加重线粒体功能障碍。IL-6不仅参与炎症反应,还可通过上调血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的表达,加重肾脏损伤[5]。IL-6通过激活JAK/STAT信号通路，促进炎症因子释放和纤维化进程。此外，IL-6还可诱导T细胞向Th17分化，进一步放大炎症反应。这提示炎症反应在DKD发病中起重要作用,而高血糖可能是诱发和维持炎症反应的关键因素。

值得注意的是,合并组IL-10水平显著低于其他两组。IL-10是一种重要的抗炎因子,具有抑制炎症因子产生、调节免疫反应的作用。IL-10主要通过以下机制发挥保护作用：①抑制NF-κB活化，减少促炎因子产生；②促进调节性T细胞分化，维持免疫稳态[6]；③下调抗原提呈细胞功能，减轻自身免疫损伤；④促进M2型巨噬细胞极化，增强组织修复能力。IL-10水平降低提示机体抗炎/免疫调节功能受损,可能是DKD合并NDKD患者预后较差的原因之一。这为临床治疗提供了新的思路,即通过上调IL-10表达来改善预后。

本研究还发现血清TNF、IL-6水平与FPG、HbA1c和hs-CRP呈显著正相关,而IL-10水平与这些指标呈负相关。这种相关性提示高血糖状态可能通过以下机制激活炎症反应：①促进晚期糖基化终产物(AGEs)形成，激活其受体RAGE介导的炎症信号；②增加氧化应激水平，产生过量活性氧簇(ROS)；③诱导内质网应激，活化炎症信号通路；④干扰线粒体功能，加重组织损伤[7]。这些机制相互作用，形成“高血糖-炎症-组织损伤”的恶性循环。因此,严格控制血糖不仅可改善代谢状态,还可能通过调节免疫炎症反应发挥保护作用。此外，本研究采用CBA技术检测细胞因子，较传统ELISA方法具有多个优势：样本用量少、检测通量大、重复性好。这为今后开展大规模临床研究提供了可靠的技术支持。

总之，血清Th1、Th2细胞因子在DKD、NDKD及两者并存患者中表达谱存在特异性差异。TNF、IL-6水平升高和IL-10水平降低可能参与疾病进展。血清细胞因子检测对于评估疾病活动度和预后具有重要参考价值，为临床诊治提供新的思路。

参考文献：

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[7]苏冬月,薛磊,庞妩燕.2型糖尿病患者血清Th1和Th2细胞因子的表达及意义[J].山东医药,2014,54(40):42-44.