镍纹蛋白样β对脂多糖诱导心肌细胞损伤的保护机制

【摘要】目的：研究镍纹蛋白样β（Metrnβ）对脂多糖（LPS）诱导心肌细胞损伤的保护效应及机制。方法：选取处于对数增殖期的脂多糖（LPS）诱导H9c2心肌细胞样本20份，给予镍纹蛋白样β培养及细胞处理，对比处理前后炎性因子水平、氧化应激反应指标、谷胱甘肽及抗铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4指标、细胞铁含量及细胞炎症信号分子Toll样受体4表达量。结果：处理前炎性因子水平与处理后对比，有统计学对比意义P＜0.05；处理前氧化应激反应指标与处理后对比，有统计学对比意义P＜0.05；处理前谷胱甘肽及抗铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4指标与处理后对比，有统计学对比意义P＜0.05；处理前细胞铁含量及细胞炎症信号分子Toll样受体4表达量与处理后对比，有统计学对比意义P＜0.05。结论：镍纹蛋白样β可减轻脂多糖诱导引发的心肌细胞损伤情况，保护机制与降低氧化应激及铁死亡相关。

【关键词】镍纹蛋白样β；脂多糖；心肌细胞损伤；氧化应激

脓毒血症作为重症监护病房的高发疾病，造成的心肌损害与心功能异常已成为影响患者生存质量及转归的主要原因。最新研究显示，脓毒血症所致的心脏炎症反应可能与铁依赖性细胞死亡机制存在关联，铁依赖性细胞死亡在心血管病变特别是急性心肌损伤过程中发挥一定作用[1]。铁稳态失衡会导致二价铁离子浓度上升，细胞膜磷脂重构增强氧化应激敏感性，这些病理变化最终造成脂质过氧化物堆积并触发细胞凋亡。基于此，阻断心肌细胞铁死亡通路有望成为脓毒血症相关心脏保护的新策略[2]。镍纹蛋白样β（Metrnβ）作为一种新近鉴定的肌源性及脂肪源性激素，其分泌水平在运动刺激和低温暴露条件下升高，通过诱导脂肪组织中交替活化型巨噬细胞分化，可有效促进白色脂肪向棕色脂肪转化来调控能量代谢，并能够参与固有免疫、适应性免疫及炎症信号通路的调控。冠心病患者循环Metrnβ浓度与心血管不良事件发生率及预后显著相关[3]。本研究评估Metrnβ对LPS介导的心肌细胞损伤的保护机制进行分析，并深入探究与炎症调控、氧化应激及铁死亡通路的相关性，报道如下。

1. 资料与方法

1.1一般资料

选取处于对数增殖期的脂多糖（LPS）诱导H9c2心肌细胞样本20份。

1.2方法

采用H9c2心肌细胞系，基础培养基选用美国Thermo Fisher公司生产的DMEM培养液，细胞活性检测使用Abcam公司出品的MTT检测试剂盒。氧化应激指标测定采用Med Chem Express公司提供的DCFH-DA荧光探针。使用Beyotime生物技术公司的谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）活性检测试剂盒。心肌损伤标志物检测选用碧云天生物技术有限公司的乳酸脱氢酶测定试剂盒。炎症因子检测采用Biolegend公司生产的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）及白细胞介素6（IL-6）检测试剂盒。氧化应激相关指标测定使用碧云天公司提供的活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）及还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒。细胞信号通路研究采用Abcam公司生产的Toll样受体4（TLR4）特异性抗体。

细胞处理：将处于对数生长期的H9c2心肌细胞接种在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中常规培养，应用1mg/L LPS与200ng/mL Metrnβ混合液处理，加入PBS缓冲液持续作用12小时。

1.3观察指标

检测指标：炎症因子水平测定：采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha， TNF-α）、白细胞介素-1（interleukin-1，  IL-1）和白细胞介素-6（interleukin-6 ， IL-6）的蛋白表达水平。细胞氧化应激指标：采用酶联免疫吸附法测定活性氧（active oxygen ，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及还原型谷胱甘肽（reduced glutathione hormone ，GSH）。谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4，Gpx4）：催化活性全程严格参照试剂盒操作指南执行。细胞铁离子浓度（Fe2+）：运用全铁显色检测技术，所有操作步骤均遵循检测试剂盒规范要求。细胞炎症信号分子Toll样受体4（Cell inflammatory signaling molecule Toll-like receptor 4，TLR4）：采用蛋白质印迹技术进行检测，通过Image J图像分析软件定量检测目标蛋白条带的灰度值计算TLR4的相对表达水平。

1.4统计学方法

 研究数据通过SPSS23.0软件进行处理，计量资料符合正态分布，采用（）表示，采用独立样本t检验，统计显著性水平设定为P<0.05。

2.结果

2.1处理前后炎症因子水平比较

处理后炎症因子水平与处理前对比指标较低，有统计学意义P＜0.05，见表1。

表1处理前后炎症因子水平比较（）

2.2处理前后细胞氧化应激指标比较

处理后细胞氧化应激指标比较处理前更低，有统计学意义P＜0.05，见表2。

表2处理前后细胞氧化应激指标比较（）

2.3处理前后GSH、Gpx4比较

处理后GSH、Gpx4与处理前相比更高，有统计学对比意义P＜0.05，见表3。

表3处理前后GSH、Gpx4比较（）

2.4处理前后Fe2+、TLR4比较

处理后Fe2+、TLR4对比处理前偏低，有统计学意义P＜0.05，见表4。

表4处理前后Fe2+、TLR4比较（）

3.讨论

脓毒血症及其引发的全身性炎症反应可导致多器官功能障碍，其中心脏功能受损尤为常见。作为革兰阴性菌的关键毒性成分，LPS不仅是脓毒血症的重要触发因子，还被广泛应用于建立脓毒症动物模型[4]。实验数据表明，相较于Metrnβ处理组和空白对照组，LPS处理组呈现出LDH释放量显著增加及细胞增殖能力明显下降的特征，证实LPS成功诱导心肌细胞损伤模型的建立。 Metrnβ作为一种新型脂肪细胞因子，在调节脂质代谢平衡、炎症反应调控及免疫相关疾病中具有重要生物学功能[5]。最新临床研究发现，Metrnβ浓度与冠状动脉粥样硬化性心脏病、2型糖尿病等代谢性疾病的发病风险存在显著相关性。Metrnβ预处理组显示出更高的细胞增殖活性和更低的LDH泄漏量，Metrnβ可能通过抑制LPS的细胞毒性作用来保护心肌细胞，可进一步维持细胞活力并减少胞内酶的外泄[6]。

现阶段，铁死亡已被证实是脓毒血症诱发心肌损伤的关键病理机制之一。这种特殊形式的细胞死亡与已知的其他死亡模式存在显著差异，细胞膜结构保持完整、胞内未见空泡形成、细胞核形态正常且无染色质固缩现象，同时，伴随有线粒体体积缩小和膜密度升高等特异性改变。当铁代谢紊乱导致铁离子异常蓄积时，可触发铁死亡的发生[7-8]。阐明铁死亡在心肌缺血再灌注损伤中的关键作用，并证明通过干预铁死亡能有效减轻I/R导致的心肌损伤。后续研究进一步发现，在心脏移植术后再灌注诱发的无菌性炎症过程中，铁死亡会促进中性粒细胞浸润，从而加重心肌炎症反应。谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）作为调控铁死亡的核心蛋白，其表达缺失会导致小鼠心肌脂质过氧化程度加剧，显著增加心肌细胞铁死亡的发生率。

本文研究显示，处理前炎性因子水平与处理后对比，有统计学对比意义P＜0.05；处理前氧化应激反应指标与处理后对比，有统计学对比意义P＜0.05；处理前谷胱甘肽及抗铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4指标与处理后对比，有统计学对比意义P＜0.05；处理前细胞铁含量及细胞炎症信号分子Toll样受体4表达量与处理后对比，有统计学对比意义P＜0.05。Metrnβ与LPS处理组均表现出细胞内Fe2+浓度上升和Gpx4蛋白表达量下降的特征，LPS引发的心肌细胞损伤过程中起着关键作用。Metrnβ能够有效缓解LPS所导致的铁死亡现象，进而对心肌细胞起到保护作用。铁死亡是一种受多因素调控的复杂生物学现象。研究表明，含有不饱和脂肪酸的磷脂发生过氧化反应是该过程的核心机制。已有文献证实，铁死亡的启动需要同时满足三个必要条件：铁离子蓄积、谷胱甘肽水平下降以及脂质过氧化反应。LPS处理组细胞内活性氧（ROS）及脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）含量显著升高，抗氧化物质谷胱甘肽（GSH）水平明显降低，这证实LPS能够增强心肌细胞的氧化应激反应。Metrnβ浓度降低与胰岛素敏感性下降、血管内皮功能障碍及动脉粥样硬化进展存在相关性，Metrnβ具有促进血管内皮细胞增殖的作用，并能有效降低心肌梗死后的心功能恶化风险，Metrnβ能够有效拮抗LPS诱导的心肌细胞氧化损伤，促使NF-κB从胞质向核内转移，继而引发TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子的过度表达[9-10]。

综上所述，镍纹蛋白样β减少氧化应激，进一步调控脂多糖诱导引发的心肌细胞损伤情况。

参考文献：

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