细胞骨架蛋白4在胸主动脉瘤/夹层形成中的作用及机制研究

摘要：【目的】探究细胞骨架蛋白4（Ckap4）缺失引发的内质网应激与血管平滑肌细胞（VSMC）表型转化在胸主动脉瘤或夹层（TAAD）形成中的作用及机制。【方法】收集TAAD患者临床样本，进行多种染色及实验，分析相关基因和蛋白表达；开展单细胞转录组学和蛋白组学测序，利用生物信息学分析数据，筛选调控CKAP4的上下游因子；构建TAAD小鼠模型，明确Ckap4与EIF4A1蛋白互作关系及对内质网应激相关蛋白表达的影响。【结果】TAAD组织中CKAP4和平滑肌细胞标志物表达降低，内质网应激相关基因和蛋白表达上调，TGFβ1信号通路相关蛋白表达上调；单细胞多组学测序发现主动脉弓VSMC中存在Ckap4low亚群，其表达低水平VSMC收缩态表型相关蛋白，筛选出调控CKAP4的上下游因子；Ckap4 -/-小鼠更易形成TAAD，VSMCs中收缩型标志物表达降低，证实Ckap4与EIF4A1蛋白互作，Ckap4缺失导致内质网应激相关蛋白表达上调。【结论】Ckap4缺失引发的内质网应激在VSMC表型转化及TAAD形成中起关键作用，为TAAD发病机制提供新视角，为早期诊断、判断预后提供新指标，为开发新治疗策略提供理论依据。

关键词：胸主动脉瘤/夹层；细胞骨架蛋白4；内质网应激；表型转化；单细胞测序

胸主动脉瘤或夹层（Thoracic Aortic Aneurysm or Dissection，TAAD）作为一种极为凶险的主动脉疾病，具有极高的致死率与致残率，严重威胁着患者的生命健康。该疾病的发生发展过程错综复杂，受到多种因素的综合影响，包括但不限于遗传因素、高血压、动脉粥样硬化、结缔组织疾病等【1】。

在TAAD的病理生理机制中，血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells，VSMC）的表型转化占据着核心地位。正常生理状态下，VSMC呈现出收缩表型，维持着血管壁的结构完整性和收缩功能，这对于维持正常的血压和血流动力学至关重要【2】。然而，在TAAD的发生过程中，VSMC会发生表型转化，逐渐从收缩表型转变为合成表型。处于合成表型的VSMC增殖能力增强、迁移能力提高，同时开始合成并分泌大量的细胞外基质成分，如胶原蛋白、弹性蛋白等。这种表型转化会破坏血管壁的正常结构和功能，导致血管壁变薄、弹性降低，最终可能引发主动脉瘤的形成或夹层的发生。

CKAP4（Cytoskeleton Associated Protein 4）是一种内质网相关蛋白，在细胞内发挥着多种重要的生物学功能。它不仅参与维持细胞骨架的稳定性和完整性，还在内质网稳态的调节中扮演着关键角色【3】。内质网作为细胞内重要的细胞器，负责蛋白质的合成、折叠、修饰以及钙离子的储存等重要生理过程。内质网稳态的失衡，即内质网应激的发生，会引发一系列细胞内信号通路的激活，进而影响细胞的生存、增殖、分化等生物学行为【4】。

鉴于CKAP4在维持细胞骨架和内质网稳态中的重要作用，以及VSMC表型转化在TAAD形成中的核心地位，我们推测Ckap4的缺失可能会引发内质网应激，进而通过一系列复杂的信号转导途径影响VSMC的表型转化，最终促进TAAD的形成。然而，目前关于Ckap4缺失与TAAD发生发展之间关系的具体机制尚不清楚。因此，本研究旨在系统而深入地探讨Ckap4缺失如何通过引发内质网应激，进而影响VSMC的表型转化，并最终促进TAAD的形成。通过收集TAAD患者的临床样本，结合细胞实验和小鼠模型等多种研究手段，从分子、细胞和整体动物水平全面揭示Ckap4在TAAD发生发展中的作用机制，为TAAD的发病机制提供新的理论依据，为早期诊断、判断预后提供新的生物标志物，同时也为开发新的治疗策略提供潜在的治疗靶点。

一、材料与方法：

1.临床样本收集与分析

1.1 患者资料收集：纳入2023年1月~2024年12月上海市第十人民医院及崇明分院心脏中心需行胸主动脉弓置换术或血管内主动脉修复术的TAAD患者80例，详细记录患者的临床资料、实验室检查结果、影像学检查结果及手术信息。

1.2 组织样本处理：分离患者的病变组织和毗邻相对正常组织，进行固定包埋、石蜡切片，并进行HE染色、弹力纤维染色和TUNEL实验。采用免疫荧光染色（IF）比较CKAP4、CNN1和αSMA等蛋白的表达水平。提取RNA和蛋白，通过RT-qPCR和Western blot（WB）评估相关基因和蛋白的表达水平。

1.3 内质网应激分析：提取RNA和蛋白，通过RT-qPCR和WB评估内质网应激相关基因（如p-eIF2α、eIF2α、CHOP等）和蛋白的表达水平。通过透射电镜检查明确内质网形态和结构的变化情况。

1.4 TGFβ1信号通路分析：通过IF和WB明确TGFβ1信号通路相关蛋白（如TGFβ1、SMAD2、pSMAD2和γH2Ax等）的表达水平。

2.单细胞多组学测序

2.1 样本收集与测序：纳入TAAD患者，获取病变组织和毗邻相对正常组织，进行单细胞转录组学和蛋白组学测序。

2.2 生物信息学分析：利用生物信息学手段，联合分析单细胞转录组学和蛋白组学数据，明确CKAP4在VSMC中的表达模式，筛选并验证调控CKAP4的上游因子和下游靶点。同时，探讨不同性别对单细胞转录组学、蛋白组学和联合分析结果的影响。

3.临床病例处理技术路线（图1）

图1：临床病例收集技术路线图

4.小鼠模型构建与验证

4.1 TAAD模型构建：在上海市第十人民医院动物实验中心，利用Itga8-CreERT2小鼠，通过微泵持续皮下泵入Ang II（1000ng/kg/min）和腹腔注射AAV9-PCSK9（D377Y），构建TAAD模型。继续高脂喂养4周后处死小鼠，收集主动脉组织进行后续分析。

4.2 VSMC原代培养与检测：在上海市第十人民医院动物实验中心，原代培养Ckap4-/-小鼠VSMCs，通过qPCR明确其对表型转化相关基因（如MYH11、ACTA2和TAGLN等）的影响。通过RNA pulldown和WB明确Ckap4与EIF4A1蛋白的互作关系，以及其对内质网应激相关蛋白表达的影响。

二、结果：

1.临床样本分析结果（图2）

1.1 CKAP4表达变化与内质网应激：TAAD组织中CKAP4和平滑肌细胞标志物的表达水平显著低于非TAAD组织。

1.2 内质网应激：TAAD组织中内质网应激相关基因和蛋白的表达水平显著上调，透射电镜检查结果显示内质网形态和结构发生明显变化。

1.3 TGFβ1信号通路：TAAD组织中TGFβ1信号通路相关蛋白的表达水平上调，提示该信号通路在TAAD形成中可能发挥重要作用。

图2：TAAD组织中CKAP4表达和内质网应激

A. 人相对正常主动脉组织（non-TAAD）和胸主动脉瘤/夹层（TAAD）组织中CKAP4蛋白表达水平; B. 人non-TAAD 和TAAD 组织中CKAP4免疫荧光染色；C. 人non-TAAD 和TAAD 组织中内质网应激相关蛋白表达水平。

2.单细胞多组学测序结果（图3）

2.1 CKAP4low VSMC亚群：在主动脉弓VSMC中发现Ckap4low亚群，该亚群表达低水平的VSMC收缩态表型相关蛋白。

2.2 差异表达基因：Ckap4low VSMC中高表达与细胞外基质、胶原纤维组织等相关的基因，而Ckap4high VSMC中高表达与VSMC收缩功能相关的基因。GO分析进一步证实了这些差异表达基因的功能富集情况。

2.3 上游因子与下游靶点：通过联合分析单细胞转录组学和蛋白组学数据，筛选出了调控CKAP4的上游因子和下游靶点，为后续机制研究提供了线索。

图3. 主动脉弓与胸主动脉VSMC不同的基因表达模式

A. 6 周龄雄性ApoE-/-小鼠主动脉弓（AAr）与胸主动脉（TA）VSMC亚群t-SNE降维图；B-C. 对主动脉及胸主动脉VSMC差异表达基因的功能聚类（细胞过程）分析；D. VSMC根据其基因表达特征被分为10个亚群；E. 小鼠主动脉弓与胸主动脉VSMC亚群的基因表达水平及分布的比较。

3.小鼠模型验证结果（图4）

3.1 TAAD模型：Ckap4-/-小鼠在Ang II和AAV9-PCSK9诱导下更易形成TAAD，且术后生存率显著降低。

3.2 VSMC表型转化：Ckap4-/-小鼠VSMCs中收缩型标志物的表达水平显著降低，提示Ckap4缺失促进了VSMC的表型转化。

3.3 互作蛋白：通过RNA pulldown和WB实验，证实了Ckap4与EIF4A1蛋白的互作关系，并发现Ckap4缺失导致内质网应激相关蛋白的表达水平上调。

图4：a. Ckap4-/-与野生型小鼠主动脉组织的内质网应激相关基因的蛋白印迹；b. Ckap4-/-与野生型小鼠形成的TAAD的EVG染色；c. Ckap4-/-与野生型小鼠（雄性）接受AAV9-PCSK9+AngII造模之后的生存曲线。

三、讨论：

胸主动脉瘤/夹层（TAAD）是一种隐匿性强、发病凶险、死亡率高的主动脉疾病，但目前针对TAAD治疗手段有限，只有开胸主动脉弓置换术或血管内主动脉修复术【5-6】。因此，揭示TAAD致病机制、探寻TAAD的治疗方法，对挽救患者生命具有重要意义。本研究首次揭示了Ckap4缺失引发的内质网应激在VSMC表型转化及TAAD形成中的重要作用。通过临床样本分析、单细胞多组学测序以及小鼠模型构建与验证，我们系统地探讨了Ckap4在VSMC表型转化及TAAD形成中的分子机制。研究发现，Ckap4low VSMC亚群在主动脉弓中的高表达可能与该区域的高血流动力学刺激和细胞异质性有关，而Ckap4缺失则通过引发内质网应激，促进了VSMC的表型转化，并最终促进了TAAD的形成。此外，我们还筛选出了调控CKAP4的上游因子和下游靶点，为后续机制研究提供了重要线索。

四、结论：

本研究通过临床样本分析、单细胞多组学测序以及小鼠模型验证，系统揭示了Ckap4缺失引发的内质网应激在VSMC表型转化及TAAD形成中的关键作用。Ckap4的缺失导致VSMC中内质网应激的发生，进而促进了VSMC的表型转化，这是TAAD形成的重要机制之一。此外，我们还发现了Ckap4low VSMC亚群在主动脉弓中的高表达，这可能与TAAD的高发部位有关。本研究不仅为TAAD的发病机制提供了新的视角，还为TAAD的早期诊断和判断预后提供了新的临床指标，同时也为开发新的治疗策略提供了理论依据。未来，我们将进一步深入研究Ckap4及其调控网络在VSMC表型转化和TAAD形成中的具体作用机制，以期为TAAD的防治提供新的策略。

五、参考文献：

【1】MacGillivray TE, Gleason TG, Patel HJ, et al. The Society of Thoracic Surgeons/American

Association for thoracic surgery clinical practice guidelines on the ma-nagement of type B

aortic dissection[J]. Ann Thorac Surg, doi:113(4):1073-1092 (2022).

【2】Shen, Y. H. et al. Aortic Aneurysms and Dissections Series: Part II: Dynamic Signaling

Responses in Aortic Aneurysms and Dissections. Arterioscler Thromb Vasc Biol 40, e78-e86, doi:10.1161/ATVBAHA.120.313804 (2020).

【3】Zheng, P. et al. ER proteins decipher the tubulin code to regulate organelle distribution. Nature 601, 132-138, doi:10.1038/s41586-021-04204-9 (2022).

【4】吴成龙,段艳宇.细胞外基质相关蛋白致胸主动脉瘤及夹层的研究进展[J].罕少疾病杂志,2024,31(03):134-136.

【5】Niolai PO, Mohammad AZ, Bulat AZ, et al. The genetics of thoracic aortic aneurysms and dissection: a clinical perspective. Biomolecules, doi:10: 182 (2020).

【6】中国医药教育协会心脏外科分会及中国医药生物技术协会心血管外科技术与工程分会主动脉术式专家共识编写组. 主动脉术式中国专家共识——胸腹主动脉置换术 [J] . 中华胸心血管外科杂志, 2021, 37(9) : 513-515.