基于网络药理学探讨大黄黄连泻心汤治疗食管癌的作用机制

[摘要]目的：基于网络药理学，探讨大黄黄连泻心汤治疗食管癌的可能作用机制。方法：在中药系统药理学数据库与分析平台筛选并收集大黄黄连泻心汤的活性成分及其对应靶标。利用Uniprot数据库、Cytoscape3.6.1软件、String数据库、DAVID数据库进行数据处理。结果：从大黄黄连泻心汤中共得到29个候选活性成分，包括槲皮素、芦荟大黄素等，116个潜在作用靶标，包括AKT、TP53等，主要通路有Jak-STAT、PI3K-Akt等信号通路。结论：本研究基于网络药理学方法，初步探究了大黄黄连泻心汤治疗食管癌的可能作用靶标和通路，体现了中药治疗疾病多成分-多靶点-多通路的特点，为后续的深入研究提供思路。

[关键词]大黄黄连泻心汤；食管癌；网络药理学；靶标；信号通路

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国癌症死亡率中36.4%来自于消化道癌症，其中包括食管癌[1]。食管癌患者就诊后经过综合治疗5年生存率仍不足20%[2]。因此，发现更多有效治疗食管癌的中西医方法迫在眉睫。

大黄黄连泻心汤出自《伤寒论》，原方包括大黄、黄连，具有清热解毒燥湿之效，临床多用于治疗胃癌、胃癌前病变等，效果显著。前期实验研究发现，大黄黄连泻心汤水煎物对人食管癌细胞增殖具有明显的抑制作用[3]。现代药理学表明大黄具有抗炎、泻下、抗肿瘤、作用，黄连具有保肝、抗癌等作用[4]。但目前对于该方治疗食管癌的研究仍旧比较单一，未能充分探讨其作用机制，对其临床作用的发挥和科学实验的进一步研究具有很大局限性。

网络药理学是基于系统生物学，通过大数据挖掘的方法，从科学、全面的角度分析药物作用疾病的作用机制，为中医药的研究及应用提供方向。本研究运用网络药理学的方法预测其治疗食管癌的相关靶标和通路，构建“成分-靶标-通路”网络图，全面分析探讨治疗食管癌的潜在作用机制。

1 资料及方法

1.1 药物活性成分与对应靶标的收集   

通过中药系统药理学数据库平台分别以“大黄”“黄连”为关键词检索其化学成分，根据药物代谢动力学原理[5]，获得有效化学成分信息，并同时得对应候选靶标。

1.2 活性成分候选靶标对应基因的收集    

在Uniprot数据库检索靶标对应蛋白名称，获取其名称及UniprotKB。

1.3食管癌相关靶标基因的收集   

通过人类基因数据库检索食管癌相关靶标基因。将疾病与方药对应的候选靶标基因对比，获取共同靶标基因，作为该方治疗食管癌的潜在作用靶标。

1.3 活性成分-作用靶标网络构建与分析   

将药物活性成分与治疗食管癌的潜在作用靶标导入Cytoscape3.6.1软件，构建活性成

分-作用靶标网络图。

1.4 靶蛋白互相作用网络图构建    

将大黄黄连泻心汤治疗食管癌的潜在作用靶标导入String数据库，获取蛋白互作关系，并利用相应工具绘制蛋白互作网络图。

1.5 生物学过程及通路分析   

  将潜在作用靶标基因导入DAVID数据库进行Go基因富集分析和KEGG通路富集分析[6]，运行R语言得出前20条生物过程及通路的高级气泡图。

1.6 成分-靶标-通路网络构建    

对筛选出的通路进行分析，筛选出可能与治疗食管癌相关的通路，通过Cytoscape3.6.1构建“成分-靶标-通路”网络关系图。

2 结果

2.1 大黄黄连泻心汤候选活性成分及候选靶标   

共获取大黄活性成分92个，黄连48个，筛选出大黄候选成分16个，黄连14个，剔除重复成分1个，共29个（见表1，略列前5）。同时在平台检索这些候选活性成分的靶标共200个。

表1 大黄黄连泻心汤候选活性成分

2.2 药物活性成分治疗食管癌候选靶标预测     

通过Uniprot数据库，获得大黄黄连泻心汤200个候选靶标的相应基因。将所得靶标基因与GeneCards数据库中所得食管癌相关基因做对比，筛选出可能与与食管癌有关得作用靶标116个。

2.3 成分-靶标网络构建    

将相关作用靶标导入Cytoscape3.6.1软件，构建药物活性成分-作用靶标网络（图1）。

2.4 靶蛋白互作网络图    

将潜在作用靶标基因导入String网络数据库，检索获取靶标蛋白互作关系经过工具处理后获得靶蛋白互作网络图（图2），可以看出该方治疗食管癌的靶标中相关性最高的5个靶点分别是AKT1、TP53、IL6、VEGFA、CASP3，即核心靶标。

图1 大黄黄连泻心汤成分-作用靶标网络图        图2大黄黄连泻心汤靶蛋白互作网络图

2.5 大黄黄连泻心汤中活性成分对应潜在靶标基因生物功能及通路分析    

通过DAVID数据库对大黄黄连泻心汤治疗食管癌潜在作用靶标进行Go和KEGG富集分析，Go富集分析结果显示，①CC分析中富集基因数量较大的有Extracellular space、Cytosol、Nucleus等，②MF分析富集基因数量较大的有Sequence-specific DNA binding、Transcription factor activity、Zincion binding等，③BP分析富集基因数量较大的有Positive regulation of transcription、Transcription、DNA-templated等。KEGG通路富集分析结果显示，Pathways in cancer、Hepatitis B、TNF、HIF-1、P53这5条通路与大黄黄连泻心汤对治疗食管癌关系最为密切。

2.6 成分-靶标-通路网络构建    

在筛选出的通路中，找出可能与治疗食管癌相关的通路，并将其与该方的活性成分、作用靶标三者结合，绘制成分-靶标-通路网络图（图7），可以看出共涉及15个活性成分，palmatine、Worenine等，48个作用靶标，AKT1、TP53等，涉及Jak-STAT、PI3K-Akt等信号通路。

图7“成分-靶标-通路”网络关系图

3 讨论

本研究运用网络药理学的方法，探究分析大黄黄连泻心汤治疗食管癌的作用机制，为其治疗食管癌提供证据支持，更加有利于临床的应用，也为进一步的实验研究提供思路。

本研究所获取的治疗食管癌的主要活性成分包括槲皮素（quercetin)、芦荟大黄素（aloe-emodin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、甲基黄连碱（worenine）、小檗碱（Berberine）等。有关药理研究表明槲皮素能够抑制食管癌细胞的迁移、侵袭及血管生成，可通过诱导细胞自噬增加对肿瘤细胞的抑制作用[6]。芦荟大黄素可以通过诱导癌细胞凋亡来发挥抗癌作用[7]。小檗碱可通过对IGF-1R及其介导的下游信号通路来诱导食管癌细胞的凋亡[8]。根据大黄黄连泻心汤所构建的“活性成分-作用靶标”网络图体现了其治疗食管癌多成分、多靶点的作用特点，作用机制复杂多样。

根据“靶蛋白互作网络图”分析可得，大黄黄连泻心汤治疗食管癌可能通过作用RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、肿瘤抑制因子（TP53）、白细胞介素-6（IL6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、重组人半胱天冬酶-3（CASP3）等5个靶标来发挥作用。Akt1的作用主要为促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞转移[9]。肿瘤抑制因子(TP53)是细胞周期相关基因，在促进细胞增殖和凋亡的调控方面发挥着重要作用[10]，因此更需要对此靶标的研究与关注。IL6可以增强人体内LAK细胞的诱导，从而提高杀瘤活性[11]。VEGFA与肿瘤的发展、转移、复发都有着不可忽略的关系。而CASP3是细胞凋亡途径中最为重要的执行因子之一，在食管癌细胞的凋亡中也发挥重要作用。

通过文献检索及KEGG通路富集分析可知，大黄黄连泻心汤治疗食管癌主要涉及Jak-STAT、PI3K-Akt、NF-kappaB、p53、MAPK等5条信号通路。Jak-STAT信号通路参与多种生理调节过程，包括细胞的生长、分化、造血、免疫等功能[12]。PI3K-Akt信号转导通路能够参与肿瘤新生血管及淋巴管的生成影响肿瘤转移 [13]。NF-kappaB在食管癌组织中有明显阳性表达，与食管癌的恶性程度、淋巴转移都密不可分[14]。P53是一种抑癌基因，其表达产物p53具有调控参与细胞生长、凋亡的作用。综上所述，本研究表明大黄黄连泻心汤治疗食管癌的主要活性成分可能为槲皮素、芦荟大黄素、β-谷甾醇、甲基黄连碱、小檗碱等，这些活性成分通过作用于AKT1、TP53、IL6、VEGFA、CASP3等靶标以及调节Jak-STAT、PI3K-Akt、NF-kappaB、p53、MAPK等信号通路发挥对食管癌的治疗作用。从中可以看出大黄黄连泻心汤治疗食管癌具有多成分、多靶点、多通路的特点，但本研究只是针对其治疗食管癌的可能作用机制进行预测，未能对这些作用机制进行科学实验的证实，尚存在局限性，但可以为有关实验的深一步进行提供思路与方向。 

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