中药提取物改善肝损伤的研究

摘要：目的 本实验主要研究姜黄和五味子提取物对CCl4导致的小鼠肝功能损伤的影响。方法：分别给小鼠灌胃姜黄提取物、五味子提取物、姜黄+五味子提取物混合物，通过与急性化学性肝损伤模型组（灌胃给予小鼠四氯化碳）对比，比较其谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、肝脏组织损伤情况，验证姜黄和五味子的保肝护肝功效。结果：急性化学性肝损伤模型组（灌胃给予小鼠CCl4）的谷丙转氨酶值、谷草转氨酶值、肝细胞病变程度都高于阴性对照组，且差异有统计学意义(P<0.05), 提示造模成功。姜黄和五味子提取物组的谷丙转氨酶值都显著性低于急性肝损伤模型对照组，姜黄+五味子组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶都比肝损伤模型对照组明显降低，差异有统计学意义；肝脏检查结果，五味子组的细胞病变程度比肝损伤组明显降低(P<0.05)，其它病变情况都有所减轻，但差别没有统计学意义；姜黄组的细胞坏死程度和病理总积分都有显著性降低，其它病变情况和模型组对比无统计学意义；姜黄+五味子提取物组和模型组对比，细胞坏死病理积分及病理总积分、脂肪变性有显著性下降(P<0.05)。且本中药提取物复方经安全毒理学试验证明食用安全，无任何毒副作用，可用作护肝类保健食品原料使用。结论：五味子和姜黄都能很好的减轻四氯化碳导致的小鼠肝脏急性损伤；两种提取物配伍使用效果加倍，且配伍食用安全，无毒副作用。

关键词：姜黄；五味子；肝损伤；四氯化碳；安全

中图分类号：R74

Abstract：Objective: To study the protective effects of turmeric extract and schisandra extract on liver injury induced by carbon tetrachloride in mice. Methods: Acute chemical liver injury model was established by intragastric administration of CCl4 in mice, and the damage of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and liver tissue after intragastric administration of turmeric extract, schisandra extract and turmeric + schisandra chine were compared, so as to verify the liver protection effect of turmeric and schisandra chine. Results: ALT, AST and hepatocellular lesion of CCl4 liver injury model group were higher than those of normal group, and the difference was significant (P<0.05), indicating successful modeling. ALT in turmeric and schisandra single extract groups was lower than that in CCl4 liver injury model group, and ALT and AST in turmeric + schisandra group were lower than that in CCl4 liver injury model group, the differences were significant (P<0.05). Pathological examination of liver showed that the pathological score of cell necrosis in turmeric extract group was decreased significantly (P<0.05), but there was no significant difference in other lesion types compared with model group. The pathological score of cell necrosis in schisandra chinensis extract group was decreased, and the difference was significant (P<0.05), and the other lesion types were reduced compared with the model group. The pathological scores and total pathological scores of steatosis and cell necrosis in turmeric + schisandra group were significantly decreased compared with CCl4 model group, with significant differences (P<0.05). Conclusion: Both turmeric and schisandra have obvious protective effects on acute liver injury induced by CCl4 in mice, and the combined effect is more significant.

Ke11ywords:Curcuma longa; Schisandra chinensis; Liver injury; Carbon tetrachloride

急性肝损伤是临床上常见的肝脏疾病，许多因素如化学物质、感染、缺血、药物及酒精等均会造成急性肝脏损伤，引发肝功能的不全［1］。肝损伤长期影响，会引起纤维化、硬化等疾病，进而对人体身心健康造成巨大伤害。中药护肝药物较西药安全性高，因此备受市场青睐。姜黄属姜科植物，《中国药典》中指出以姜黄的干燥根茎入药，味辛，归脾、肝经。有文献报道姜黄对肝脏具有保护作用，它是药食同源植物，主要保护作用成分为姜黄素［2-3］。姜黄素对肝脏疾病症状的预防和改善作用源于其抗氧化、抗炎症作用，其护肝作用主要在于抑制肝纤维化［4］。木兰科植物五味子的干燥成熟果实口感酸涩，药性温热。中医理论和现代药理学研究发现五味子是收敛肝阴、补益肝气之良药，可激活肝脏受损细胞，促进肝修复。木兰科植物五味子的干燥果实味酸、甘，温。归肺、心、肾经。是益气生津、补肾宁心、收敛固涩的中药。有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之功，常用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，津伤口渴，心悸失眠。中药五味子单味或与其他中药配伍用于急、慢性肝损伤的治疗，可以促进损伤肝细胞的修复、降低血清谷丙转氨酶(ALT)活性[5]。经文献查阅发现，关于姜黄素、五味子对化学性肝损伤有辅助保护作用的研究有很多［6-9］。本实验通过观察姜黄、五味子、两药复配对CCl4引起的肝脏急性损伤是否有良好效果，及其两药复配的安全性，深入思考养肝护肝类保健食品原材料的开发和应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试样品

提取物均由西安某公司提供。姜黄提取物经70%乙醇提取浓缩干燥所得，每1g提取物约相当于10g生药；五味子提取物经70%乙醇提取浓缩干燥所得，每1g提取物约相当于12.5g生药；姜黄+五味子组为姜黄提取物:五味子提取物=3:2。

1.1.2 实验动物

昆明雄性小鼠100只，SD大鼠100只，雌雄各半；SPF级。

1.1.4 剂量选择

按成人(体重按60.0kg计)日摄入量10倍设姜黄提取物剂量为30mg/kg体重、五味子提取物剂量为20mg/kg 体重、两药复配组剂量为50mg/kg 体重，同时设急性肝损伤模型组和阴性对照组。

1.1.5 样品配制：每次分别取姜黄提取物60mg、五味子提取物40mg、姜黄+五味子提取物混合粉100mg用蒸馏水溶解、混匀。阴性对照组和急性肝损伤模型组给予蒸馏水。各组剂量均为20ml/kg体重，方式是经口灌胃给予。

1.2 实验方法

动物适应3天后，进行分组，分别设阴性对照组（蒸馏水组）、四氯化碳导致急性肝损伤模型对照组和三种剂量组。参考1.1.5，实验期间蒸馏水照组和肝损伤对照组以灌胃方式给予同体积的蒸馏水，各样品组灌胃给予不同浓度的药物，连续30天。第30天，所有小鼠不允许进食，16h后各组（除阴性对照组）以灌胃方式一次性给小鼠四氯化碳（5ml/kg 体重）从而进行急性化学性肝损伤造模。四氯化碳灌胃间隔4.5h，各样品组继续给予不同剂量受试物至实验结束，蒸馏水组组给予玉米油灌胃。各组（除阴性对照组）灌胃给予四氯化碳后24h进行麻醉处理，采血、分离血清，测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶值，做肝脏病变学检查，观察肝脏的损伤情况。参考《保健食品功能学评价程序和检验方法》的标准进行量化，肝脏病变观察指标有肝细胞“细胞坏死、胞浆凝聚、水样变性、气球样变、脂肪变性”等。

1.3 数据统计与分析

数据的统计处理采用统计软件分析比较：根据方差齐和方差不齐，分别采取不同的分析比较方式。

2 结果与分析

2.1 样品对小鼠体重的影响

由表1可见，经口给予不同剂量的样品30天，和阴性对照组相比，姜黄提取物组、五味子提取物组、姜黄+五味子组、CCl4模型组的小鼠体重、增重差异不明显不明显（P＞0.05）。

表1  对小鼠体重的影响(±s)

2.2 样品对动物血清ALT、AST的影响

如下表2，CCl4模型组的AST、ALT值都比阴性对照组显著升高(P<0.01)，说明造模成功。五味子提取物组的谷丙转氨酶值低于CCl4模型组，有统计学意义(P<0.05)；姜黄提取物组的谷丙转氨酶值也低于CCl4模型组，有统计学意义(P<0.05)；和CCl4模型组比较，姜黄+五味子组的谷丙转氨酶值极明显降低(P<0.01)；谷草转氨酶值也显著性降低(P<0.05)。

表2  对小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的影响(±s)

##：和阴性对照组比较P<0.01，*：和急性肝损伤模型对照组比较P<0.05，**：和急性肝损伤模型对照组比较P<0.01

2.3 样品对肝脏病变的影响

肝脏病理学检查发现，和阴性对照组相比，四氯化碳模型组的病理积分极显著增高(P<0.01), 说明造模成功。姜黄提取物组的肝脏细胞坏死和病理总积分显著性降低，和肝损伤模型对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05)，其他病变类型如气球变性积分、爆浆凝聚积分有降低，气球变性积分有所升高，但和急性肝损伤模型对照组比较，均无统计学意义(P>0.05)。五味子提取物组的细胞坏死积分显著性下降(P<0.05)，其他病变分数虽有降低，但是和急性肝损伤组比较无统计学意义(P>0.05)。姜黄+五味子组脂肪变性病变积分、细胞坏死病变积分、总积分都有降低，和肝损伤模型对照组比较，差异都有统计学意义(P<0.05)，其他病变类型也有下降，但和模型对照组比较差异不显著(P>0.05)。

表3  病理检查总积分

*：和急性肝损伤模型对照组比较P<0.05，**：和急性肝损伤模型对照组比较P<0.01

2.4安全性试验

已有研究报道证实姜黄、五味子单独使用的安全性。如李然[11]证实姜黄素经动物毒性实验,无明显亚慢性毒性损害作用,也无潜在的致突变、致畸作用。何来英[12]证实五味子乙醇粗提物长期食用是安全的。本研究旨在探讨姜黄提取物和五味子提取物复配的安全性。在所做安全性毒理实验中，未观察到姜黄提取物+五味子提取物复方对动物有安全方面的影响。试验结果如下：

2.4.1 急性经口毒性试验

大鼠急性经口毒性试验结果表明：本样品 LD50＞10.0g/kg体重，急性毒性（LD50）剂量分级为实际无毒。

2.4.2 三项遗传毒性试验

细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

2.4.3 28天经口毒性试验

试验按姜黄+五味子提取物混合粉人体日推荐剂量的25倍、50倍和100倍，设0.125g/kg体重、0.250g/kg体重、0.500g/kg体重3个剂量连续经口灌胃给予SD大鼠28天。动物未见与受试物有关的中毒表现，大鼠体重、体重增重、血液学、血生化、脏体比等均无异常改变；病理检查也未见不良影响。结果显示在本试验条件下，本姜黄五味子提取物复合物对SD大鼠28天经口毒性试验未观察到有害作用剂量（NOAEL）大于0.5g/kg体重。

姜黄提取物+五味子提取物复方安全毒理学试验表明，姜黄五味子复合物食用安全，无任何毒副作用。

3 小结

四氯化碳常用作急性化学性肝损伤实验模型。李红侠等[10]在观察沙苑子对四氯化碳所致大鼠肝损伤的保护作用实验中，以姜黄素为阳性对照物，验证了姜黄素在肝脏病理中，血清ALT/AST值均明显降低，具有抗肝损伤的作用。邹国良[13]在姜黄素对CCl4所致急性肝损伤的保护作用研究一文中，通过建立四氯化碳肝损伤模型，来探究姜黄素对急性肝损伤的影响。实验结果模型组大鼠可见肝细胞坏死病变，姜黄素治疗组的肝细胞对比模型组坏死改变有所减轻，其高剂量组的效果最为明显。表明姜黄素能积极改善CCl4所致的肝细胞损伤。五味子的护肝作用机制主要因为它有丰富的木脂素类成分，这些成分能够借助激活Nrf2信号通路的方式，降低肝细胞所遭受的氧化应激损伤。此外，五味子提取物还能抑制炎症因子释放，减少炎症细胞浸润，降低促凋亡蛋白的表达，从而减轻肝损伤。现代药理研究还发现，五味子能促进肝细胞蛋白质合成，增强肝脏解毒功能，帮助肝脏排出毒素。在地五养肝胶囊治疗肝病的理论依据[14]一文中，指出姜黄辛温通络、活血化瘀，五味子可清热养阴、酸甘化阴，而由姜黄、五味子、甘草等中药组成的配方可以补肾而养肝、利湿而退黄、活血而通络为原则，体现出“开源截流”“补泻兼施”的配伍规律，从而达到抗炎保肝、调控肝再生的作用。且临床应用表明地五养肝胶囊对肝病具有良好的治疗效果，是一种安全有效的治疗肝病的药物。“补肾生髓成肝”调控肝肾精虚大鼠肝再生的作用及机制研究[15]一文中，描述了以“补肾生髓成肝”治疗法则制成的中药方剂，由熟地、五味子、姜黄、茵陈、甘草等组成，其中熟地能甘温补肾而养阴，五味子能增强补肾的功能，两药配合直接补肾为主；茵陈苦泄下降，专攻清热利湿，为退黄要药，统领全方疏泄肝胆郁热、渗利中焦湿浊为主药，姜黄辛温行散，既助主药通络以促湿邪外泄，又活血化瘀以解肝络瘀阻为辅药，生甘草生甘草清热解毒，调和诸药，兼防苦寒伤胃，合为三海。五味子酸收生津，合甘草之甘缓，酸甘化阴以滋肝肾之阴，兼制温燥；甘草还可载药上行，引诸药入肝经，调和药性；共为佐使药，全方共奏疏利肝胆而退黄浊、活血通络而消瘀滞、滋阴敛液而补肝体之功效。功效：滋肾柔肝、利湿退黄、活血通络。主治：慢性肝炎肝损伤日久引起的肝体亏虚、瘀热互结诸证。全方体现“开源截流”、“通补兼施”的配伍规律，该疗法凭借降低肝组织损伤、推动肝再生修复的双重功效，用以治疗慢性肝病之肝肾阴虚证，助力肝脏组织结构的重新构建，促使其功能逐步恢复。目前，该制剂已在临床领域展开推广应用，获得良好的治疗效果。

本实验采用四氯化碳导致小鼠急性肝损伤模型，结果发现，对比阴性对照组，模型组AST、ALT均呈显著性增高；同时模型组肝细胞坏死程度严重高于阴性对照组，提示造模成功。小鼠给予姜黄提取物、五味子提取物及两者配伍均可抑制CCl4造成的肝损伤，和CCl4肝损伤模型组对比，姜黄、五味子提取物组的血清谷丙转氨酶都显著性降低，姜黄+五味子组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶都比四氯化碳肝损伤模型组低，且差异有统计学意义(P<0.05)。肝脏检查结果，五味子提取物组的细胞坏死病变程度较肝损伤对照组显著性降低(P<0.05)，其它病变情况和肝损伤对照组对比有所减轻；姜黄提取物组的细胞坏死病变程度及病变总积分都有显著性降低，和肝损伤对照组对比有统计学意义，对比其它病变情况均无显著性变化；姜黄+五味子提取物组在改善肝脏病理方面比提取物单独使用更优，和肝损伤对照组对比，细胞坏死病变积分及病变总积分、脂肪变性病变积分均有显著性下降(P<0.05)，其它病变类型也有减轻，但是差异不显著。且本中药提取物复方经安全毒理学试验证明食用安全，无任何毒副作用，可用作护肝类保健食品原料使用。结论：五味子和姜黄都能很好的减轻四氯化碳导致的小鼠肝脏急性损伤。两种提取物配伍使用效果加倍，且配伍食用安全，无任何毒副作用。

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作者简介：毕大祥（2002-），男，汉族，安徽淮南人，硕士，研究方向为中药学。