VE-cadherin降解在高毒力肺炎克雷伯菌致肺损伤中的作用

摘要：目的 通过建立高毒力肺炎克雷伯菌肺炎大鼠模型，检测血管内皮细胞间粘附蛋白（VE-cadherin）的变化，探索VE-cadherin降解在高毒力肺炎克雷伯菌致肺损伤中的作用。方法 建立高毒力肺炎克雷伯菌肺炎大鼠模型，采用HE染色，在显微镜下观察各组大鼠肺组织的病理变化;采用酶联免疫吸附法检测检测血清、肺泡灌洗液中VE-cadherin的浓度;采用实时荧光定量检测肺组织中VE-cadherin mRNA相对表达量的变化。结果 实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点血清血VE-cadherin水平较对照组显著下降（P＜0.05）；实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点肺泡灌洗液VE-cadherin水平较对照组显著下降（P＜0.05）；实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点肺组织VE-cadherin mRNA相对表达量较对照组显著下降（P＜0.05）。结论 高毒力肺炎克雷伯菌感染将导致VE-cadherin在肺组织表达的下降，导致急性肺损伤。

关键词：高毒力肺炎克雷伯菌；VE-cadherin；肺损伤

中图分类号：R473

Role of VE-cadherin degradation in lung injury caused by highly virulent Klebsiella pneumoniae

Zhu Diyang  Xu YuHui

1.Department of Internal Medicine, The Second People's Hospital of Yudu County, Ganzhou 341000

2.Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Ganzhou People's Hospital, Ganzhou 341000

Abstract：Objective  Establish a rat model of Klebsiella pneumoniae pneumonia with high virulence，detecte the changes of vascular endothelial intercellular adhesion protein (VE-cadherin),explore the role of VE-cadherin degradation in lung injury caused by highly virulent Klebsiella pneumoniae .Methods Establish a rat model of Klebsiella pneumoniae pneumonia with high virulence,use HE staining,observe the pathological changes of lung tissue of rats in each group under microscope,use Enzyme-linked immunosorbent assay  to detect the concentration of VE-cadherin in serum and alveolar lavage fluid,use real-time fluorescence quantification to detect the relative expression of VE-cadherin mRNA in lung tissue.Results The level of serum VE-cadherin in the experimental group was significantly lower than that in the control group at 1 hour, 12 hours, 24 hours, 48 hours and 72 hours（P＜0.05）,The level of VE-cadherin in alveolar lavage fluid in the experimental group was significantly lower than that in the control group at 1 hour, 12 hours, 24 hours, 48 hours and 72 hours（P＜0.05）,The relative expression of VE-cadherin mRNA in lung tissue of experimental group was significantly lower than that of control group at 1 hour, 12 hours, 24 hours, 48 hours and 72 hours（P＜0.05）.Conclusion Klebsiella pneumoniae infection with high virulence will lead to the decrease of VE-cadherin expression in lung tissue and lead to acute lung injury.

Key words：Klebsiella pneumoniae with high virulence;VE-cadherin;Lung injury.

高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）是肺炎克雷伯菌的一种亚型，具有毒力强、侵袭性强的特点，常引起全身不同部位的感染[1]。hvKP容易导致急性肺损伤，引起氧合功能的显著下降， 继发多脏器功能损害， 是造成高病死率的重要因素之一[2]，但hvKP导致急性肺损伤的机制目前仍不明确。急性肺损伤的病理生理特点是肺水肿和透明膜的形成，其主要机制是肺血管内皮细胞屏障功能的破坏，从而导致蛋白、液体、炎症细胞等物质的大量渗出[3]。研究发现，血管内皮细胞间粘附蛋白 （VE-cadherin） 是一种内皮细胞连接蛋白，其表达水平的下降以及分布的破坏，可能是血管内皮细胞屏障功能破坏的重要调控机制[4]。本研究通过建立高毒力肺炎克雷伯菌肺炎的大鼠模型，检测血清、肺组织中VE-cadherin表达水平的变化，探讨VE-cadherin降解在高毒力肺炎克雷伯菌致肺损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠60只，体重约200g，采购于南昌大学实验动物中心，饲养温度为22℃－25℃，空气湿度为50%－60%，自然昼夜生活节律和光照环境，大鼠可自由活动和进食。

1.1.2 主要药品、试剂及设备 ：VE-cadherin ELISA试验盒，采购于武汉云克隆公司；RNA提取液采购于天根生化科技有限公司；cDNA采购于Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 高毒力肺炎克雷伯菌肺炎大鼠模型建立：高毒力肺炎克雷伯菌（NTUH-K2044）培养后用生理盐水配成 1x10^7 cfu/mL 的细菌混悬液；用乙醚深度麻醉大鼠，垂直固定大鼠，显露声门，用 12 号钝头针头插入气管内，注入高毒力肺炎克雷伯菌肺炎细菌混悬液 0.1 mL（含细菌量 1x10^6cfu/mL），保持垂直体位 5 分钟，通过以上方法复制高毒力肺炎克雷伯菌肺炎大鼠模型。

1.2.2 实验分组及标本采集：将60只大鼠随机分为实验组和对照组，每组30只，对照组由微型喷雾器将同等剂量生理盐水喷入肺部。分别于1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点，实验组、对照组分别随机选取5只大鼠进行采集外周血、肺泡灌洗液、肺组织。

1.2.3 肺泡灌洗液收集及保存：麻醉大鼠后，将气管暴露，在大鼠气管上切开一小口，将肺泡灌洗针插入大鼠左肺支气管，使用手术线结扎固定，采用注射器缓慢注入3ml生理盐水，反复吸取灌洗液，以上操作3次，收集肺泡灌洗液5ml以上，将收集的肺泡灌洗术在1500r/min速度下离心5分钟，收集上清液后放于-70℃冰箱中保存待检。

1.2.4 外周血标本采集及保存：采用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后摘除眼球方式取外周血，留取血清后放于-70℃冰箱中保存待检。

1.2.5 HE染色观察大鼠肺组织病理改变：取大鼠部分右肺组织，经甲醛固定后，全自动脱水、石蜡包埋、切片，采用HE染色，在显微镜下观察各组大鼠肺组织的病理变化。

1.2.6 ELISA测定血清、肺泡灌洗液的VE-cadherin浓度：采用酶联免疫吸附法（ELIS）检测检测血清、肺泡灌洗液中VE-cadherin的含量，严格按照试剂盒步骤进行检测。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测肺组织中VE-cadherin mRNA相对表达量的变化 ：RNA提取，肺组织50mg，加入适量RNA提取液，检测RNA的含量，逆转录成cDNA，取适量提取的RNA，严格按照说明书将RNA逆转录成cDNA，PCR扩增cDNA，VE-cadherin上游引物序列为5'-CCCACTATCCGATACGAATACC-3'，下游引物序列为5'-ATCCACATCTAGGACGTTGATG-3'，内渗基因GAPDH的上游引物序列为5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'下游引物序列5'-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3'，严格按说明书操作。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.O软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(x̄±s)表示，正态分布的计量资料组间比较采用两独立样本的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组大鼠一般情况

实验组大鼠在感染高毒力肺炎克雷伯菌后，逐渐出现运动不活泼，对外界反应迟纯，部分大鼠出现呼吸表浅而急促。

2.2 肺组织病理学观察

采用HE染色，在显微镜下观察各组大鼠肺组织的病理变化，对照组各大鼠肺泡腔无明显炎症细胞浸润；实验组大鼠可见炎症细胞浸润，并随时间增加，炎症反应更明显。

对照组 模型组

图1对照组和模型组大鼠病理改变（HE *40）

2.3 血清的VE-cadherin的变化

实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点血清血VE-cadherin水平较对照组显著下降（P＜0.05）。见表1

表1 两组大鼠血清血VE-cadherin水平（x̄±s，pg/mL）

注：#与对实验组比较P＜0.05

2.4 肺泡灌洗液的VE-cadherin的变化

实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点肺泡灌洗液VE-cadherin水平较对照组显著下降（P＜0.05）。见表2

表2  两组大鼠肺泡灌洗液VE-cadherin水平（x̄±s，pg/mL）

注：#与对实验组比较P＜0.05

2.5  肺组织的VE-cadherin mRNA相对表达量的变化

实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点肺组织VE-cadherin mRNA相对表达量较对照组显著下降（P＜0.05）。

注：*与对照组比较，P＜0.05。

图2:实验组大鼠肺组织VE-cadherin mRNA相对表达量与对照组比较

3 讨论

肺炎克雷伯菌（KP）属于肠杆菌科、克雷伯菌属，是临床上最常见的条件致病菌之一。肺炎克雷伯菌具有较厚的荚膜，荚膜多糖是重要的毒力因子，可抵抗机体的吞噬清除作用。高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）是肺炎克雷伯菌的一个重要亚型，与普通的肺炎克雷伯菌相比，高毒力肺炎克雷伯菌有更强的侵袭性和毒箭力，可在免疫功能正常人群中引起严重感染，致死率达3%-42%,其中社区获得性肺炎的病死率高达5%以上，发生多器官功能衰竭的风险明显高于其他类型的肺炎，威胁全球公共卫生的安全，因此深入研究其发病机制可以有效减少高毒力肺炎克雷伯菌的传播和感染。高毒力肺炎克雷伯菌主要的毒力因子包括荚膜多糖、脂多糖（LPS）、铁载体系统、菌毛等。脂多糖是革兰阴性细菌细胞壁组成成分，可引起严重的炎症反应，研究证实，脂多糖可以破坏血管内皮细胞屏障功能而导致急性肺损伤，高毒力肺炎克雷伯菌可能通过其脂多糖成分引起急性肺损伤。

内皮细胞间的连接是屏障功能的主要组成部分，包括紧密连接、桥粒连接、间隙连接、黏附连接等，每种成分在在维持血管的完整性、通透性方面发挥了独特的作用。血管内皮细胞间粘附蛋白 （VE-cadherin）是钙黏蛋白家族的主要成员之一，在血管内皮细胞中表达，是内皮细胞黏附连接的重要蛋白。血管内皮细胞间粘附蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区组成，胞外区有五个钙离子依赖的重复结构域，主要作用是细胞间的黏附，胞内区通过连环蛋白与细胞内的骨架连接，这些重要结构在维持内皮细胞屏障功能中起了关键的作用[5]。

急性肺损伤是严重的肺部疾病，是脓毒症、重症肺炎、全身炎症反应综合征等危重症最早出现的器官功能障碍。肺泡内大量透明膜的形成以及肺水肿的发生将导致肺内氧合水平的显著下降，进一步加速了各器官的功能障碍。急性肺损伤最重要的病理生理机制就是血管内皮屏障功能的破坏，从而导致大量蛋白、水分、炎性细胞等渗透于肺间质或肺泡，引起低氧血症甚至急性呼吸窘迫综合征，是导致患者死亡的主要原因[6]。研究发现脓毒症肺损伤中VE-cadherin被严重破坏，是导致血管内皮细胞屏障破坏的主要机制之一。但hvKP中的LPS是否将导致VE-cadherin降解而导致急性肺损伤，目前尚不可知。

本实验研究显示，采用气道内注入高毒力肺炎克雷伯菌肺炎细菌混悬液后，在显微镜下观察各组大鼠肺组织的病理变化，对照组各大鼠肺泡腔无明显炎症细胞浸润，实验组大鼠可见炎症细胞浸润，并随时间增加，炎症反应更明显，通过以上方法可以成功复制高毒力肺炎克雷伯菌肺炎大鼠模型。实验结果显示：实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点血清血VE-cadherin水平较对照组均显著下降，并随时间逐渐下降；实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点肺泡灌洗液VE-cadherin水平较对照组均显著下降，并随时间逐渐下降；实验组在1小时、12小时、24小时、48小时、72小时时间点肺组织VE-cadherin mRNA相对表达量较对照组均显著下降，并随时间逐渐下降。本研究结果表明，高毒力肺炎克雷伯菌感染将导致VE-cadherin在肺组织表达的下降。VE-cadherin在肺组织表达的下降将诱导了肺血管内皮细胞的损伤，增加了肺血管内皮细胞的通透性和完整性，导致急性肺损伤的发生。

参考文献：

[1]Marr CM,Russo TA.Hypervirulent Klebsiella pneumoniae:a new public health threat[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2019,17(2):71-73.

[2] Kruger P S, Terblanche M. Statins in patients with sepsis and ARDS: is it over? No[J]. Intensive Care Med. 2017, 43(5): 675-676.

[3] Prescott H C, Calfee C S, Thompson B T, Angus D C, Liu V X. Toward Smarter Lumping and Smarter Splitting: Rethinking Strategies for Sepsis and Acute Respiratory Distress Syndrome Clinical Trial Design[J]. Am J Respir Crit Care Med. 2016, 194(2): 147-155.

[4]Gong H, Rehman J, Tang H, Wary K, Mittal M, Chaturvedi P, Zhao Y Y, Komarova Y A, Vogel S M, Malik A B. HIF2alpha signaling inhibits adherens junctional disruption in acute lung injury[J]. J Clin Invest. 2015, 125(2):652-664.

[5] Herwig M C, Muller K M, Muller A M. Endothelial VE-cadherin expression in human lungs[J].Pathol Res Pract. 2008, 204(10): 725-730.

[6]Butt Y,Kurdowska A,Allen T C.Acute lung injury:A clinical and molecular review[J].Arch Pathol Lab Med,2016,140(4):345-350.

基金项目：江西省卫生健康委科技计划项目（项目编号：202311914）。

作者简介：朱地养（1985-）,性别：男,民族：汉族,籍贯：江西于都,学历：本科,研究方向：重症肺炎。

基金项目：江西省卫生健康委科技计划项目（项目编号：202311914）。

作者简介：朱地养（1985-）,性别：男,民族：汉族,籍贯：江西于都,学历：本科,研究方向：重症肺炎。