黄连素下调海马脑区神经元自噬水平改善海洛因成瘾小鼠学习记忆能力

摘要：目的：探讨黄连素对海洛因成瘾小鼠学习记忆功能的改善作用及其潜在机制。

方法：将30只8周龄SPF级C57BL/6J小鼠随机分为5组：黄连素低（2.5mg·kg-1·d-1）、中（5mg·kg-1·d-1）、高（10mg·kg-1·d-1）剂量组，海洛因对照组（HAG）和生理盐水对照组（SCG）。采用剂量递增法腹腔注射海洛因建立慢性依赖模型，处理组同时给予相应剂量黄连素干预。通过Morris水迷宫评估小鼠空间学习记忆能力，Western blot检测海马LC3A/B蛋白表达水平。结果：黄连素干预显著改善了海洛因成瘾小鼠的学习记忆功能，且改善效果呈剂量依赖性。Western blot分析显示，黄连素处理组海马LC3B/A比值显著低于HAG组（P<0.05），表明其可下调海马区过度激活的自噬水平。结论：黄连素能够剂量依赖性地改善海洛因成瘾导致的学习记忆损伤，其作用机制可能与调节海马神经元自噬水平有关。

关键词：黄连素；海洛因成瘾；自噬；学习记忆

Berberine Mitigates Hippocampal Neuronal Autophagy and Enhances Learning and Memory in Heroin-Addicted Mice

Objective:To explore the improvement effect of berberine on the learning and memory function of heroin-addicted mice and its potential mechanism.

Methods: Thirty 8-week-old SPF C57BL/6J mice were randomly assigned to five groups: berberine low- (2.5mg·kg-1·d-1), medium- (5mg·kg-1·d-1), and high-dose (10mg·kg-1·d-1) groups, heroin control group (HAG), and saline control group (SCG). A chronic heroin dependence model was established through dose-escalating intraperitoneal heroin injections, with simultaneous berberine administration in the treatment groups. Spatial learning and memory were evaluated using the Morris water maze, while hippocampal LC3A/B protein expression levels were measured by Western blot.

Results: Berberine administration significantly ameliorated learning and memory deficits in heroin-addicted mice, with the therapeutic efficacy exhibiting a dose-dependent manner. Western blot analysis revealed a marked reduction in the LC3B/A ratio in the hippocampus of berberine-treated groups compared to the HAG group (P<0.05), suggesting its potential to attenuate heroin-induced hyperactivation of autophagic flux in hippocampal neurons.

Conclusion: Berberine demonstrates dose-dependent ameliorative effects on heroin addiction-induced learning and memory impairments, potentially through modulating autophagy activity in

hippocampal neurons.

Key words：berberine；heroin addiction；autophagy；learning and memory

1.前言

药物成瘾是一种以强迫性依赖和戒断综合征为特征的精神疾病1。海洛因作为典型阿片类药物，因其强成瘾性和危害性在全球广泛流行2。现有治疗主要依赖阿片拮抗剂（纳洛酮、纳曲酮）和激动剂（美沙酮）。研究表明，长期阿片暴露可诱导药物相关学习（渴求和条件反射）3和非药物相关学习（如空间记忆）4的改变。Monica T等证实海洛因可损害小鼠水迷宫任务中的认知能力5，但其机制尚不明确。

海马作为学习记忆的关键脑区，长期海洛因暴露可通过这些受体干扰海马功能6，而海马作为奖赏通路的重要环节，其功能改变可能参与成瘾形成7。

自噬作为细胞内降解系统，在神经系统中具有双重作用：在慢性神经退行性疾病中起保护作用，而在急性神经损伤中可能有害8,9。研究发现，多巴胺能神经元的ATG5/ATG7依赖性自噬参与了吗啡诱导的奖赏反应10。

黄连素是一种具有抗氧化和抗炎作用的季铵生物碱，被广泛应用于神经退行性疾病治疗11。作为自噬调节剂，黄连素可诱导自噬改善疾病进程12。本研究探讨黄连素是否通过调节海洛因成瘾小鼠海马神经元自噬水平来改善学习记忆功能，通过水迷宫实验和自噬相关蛋白检测验证这一假设。

2. 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物及分组

30只8周龄SPF级C57/BL6小鼠（22±2g）随机分为5组（n=6）：生理盐水对照组（SCG）、海洛因对照组（HAG）、黄连素低剂量组（2.5mg·kg-1·d-1）、中剂量组（5mg·kg-1·d-1）和高剂量组（10mg·kg-1·d-1）。实验方案经贵州医科大学动物伦理委员会批准，符合实验动物管理条例。

2.1.2 试剂与仪器

海洛因（纯度92.09%，贵州省公安厅提供）；黄连素（北京索莱宝科技有限公司，批号：1201D021，溶于生理盐水至1mg·ml-1）；LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、β-Tubulin抗体（Proteintech公司）；SDS-PAGE凝胶、BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；通用型组织固定液（bioshar北京兰杰柯科技有限公司）。条件位置偏好仪、Morris水迷宫及动物行为分析系统（北京众实科技有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 慢性海洛因依赖模型建立

除SCG组外，其余各组小鼠采用剂量递增法腹腔注射海洛因（1, 2, 2, 4, 4, 8, 8mg·kg-1，早晚各1次）建立慢性海洛因依赖模型13，SCG组注射等量生理盐水。

2.2.2 Morris水迷宫实验

使用直径90cm、高50cm水池，水温（20±2）℃，水深（30±2）cm。实验为期8天：第1天环境适应（无平台）；第2天空间航行前测；第3-7天定位航行实验（记录逃避潜伏期，上限60s）；第8天空间探索实验（记录平台穿越次数和目标象限停留时间）。

2.2.3 Western blot

取海马组织，加入含PMSF的RIPA缓冲液制备匀浆，12000rpm离心5min（4℃）。BCA法测定蛋白浓度，煮沸变性后SDS-PAGE分离，转膜后5%脱脂奶粉封闭2h。一抗（LC3Ⅰ 1:3000，LC3Ⅱ 1:3000，β-Tubulin 1:50000）4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h。ImageJ分析条带灰度值，以β-Tubulin为内参。

2.2.4 统计分析

数据以mean±SEM表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异显著。使用Graphpad Prism 10进行数据分析和作图。

3．结果

图1 黄连素对海洛因诱导的小鼠学习记忆的影响。(A)实验流程流程图和小鼠的行为学测试。SCG，生理盐水对照组;HAG，海洛因对照组;BCG、黄连素对照组;BBR 2.5mg，黄连素2.5mg/kg;BBR 5mg，黄连素5mg/kg体重;BBR 10mg，黄连素10mg/kg体重。SCG和BCG注射生理盐水;HAG组、BBR 2.5mg组、BBR 5mg组和BBR 10mg组注射海洛因，每天2次，连续2周。(B)水迷宫训练最后一天小鼠寻找平台的时间。(C)在后测试阶段，小鼠第一次穿越平台的位置所花费的时间。(D)在后测试阶段，小鼠过平台位置的次数。(E)后测阶段小鼠在水迷宫中游泳的速度。(F)训练阶段小鼠在水迷宫中寻找平台的时间。T检验和单因素方差分析；* =p<0.05 ，* * =p<0.01。

图2黄连素对海洛因成瘾小鼠海马自噬相关蛋白表达的影响。(A)海马区具有代表性的western blot条带及LC3A(B)、LC3B(C)及其比例(D)的统计图。T检验和单因素方差分析* =p<0.05 ，* * =p<0.01。

3.1 黄连素对空间学习记忆的改善作用

适应性喂养一周后，将小鼠随机分为5组。黄连素干预组每日12:00腹腔注射相应剂量黄连素。第三周起，除SCG组外，其余各组每日9:00和21:00注射海洛因（间隔≤12h）。第四周开始行为学测试（图1A）。

水迷宫结果显示，与HAG组相比，所有黄连素干预组逃避潜伏期显著降低（p<0.05）；低、中剂量组穿越潜伏期显著缩短（p<0.05）；中、高剂量组平台穿越次数显著增加（p<0.05）。各组间游泳速度和训练期潜伏期无显著差异，提示运动能力未受影响。结果表明，中剂量黄连素对改善海洛因诱导的空间记忆损伤效果最佳，低、高剂量也显示出一定改善作用。

3.2 黄连素对海马神经元自噬的调节作用

Western blot检测海马LC3A/B表达。与SCG组相比，HAG组LC3B/A比值显著升高（P<0.05），表明自噬水平增加。中、高剂量黄连素干预显著降低LC3B/A比值（P<0.05），提示其可逆转海洛因诱导的神经元自噬过度激活（图2）。

4．讨论

海洛因滥用是严重的全球性社会问题，其强成瘾性和神经毒性导致使用者出现脑结构损伤和认知功能障碍14。目前临床使用的阿片受体激动剂/拮抗剂难以修复神经损伤，且副作用较大。本研究发现黄连素可显著改善海洛因成瘾小鼠的空间记忆能力。这与前人研究一致：黄连素可抑制吗啡诱导的条件性位置偏爱15。作为传统中药成分，黄连素是戒毒中药"福康片"的主要成分之一16。现代研究表明，黄连素通过调控氧化应激、神经保护和自噬等途径，在多种神经系统疾病中发挥治疗作用17。

自噬作为高度保守的细胞降解途径，对维持神经元功能至关重要。研究表明， LC3B/LC3A比值是评估自噬活性的可靠指标：自噬发生时，LC3A转化为LC3B，后者可被ATG-4酶转化回LC3A或被溶酶体降解18。本研究发现海洛因成瘾可导致海马神经元自噬过度激活，而黄连素通过调节LC3B表达抑制异常自噬，从而改善学习记忆功能。适度的自噬水平对维持突触可塑性和记忆形成至关重要19。

本研究首次证实黄连素对海洛因成瘾具有潜在治疗作用，为开发基于黄连素的新型戒毒药物提供了理论依据。鉴于黄连属植物资源丰富、安全性高，未来有望开展临床转化研究。

5. 结论

研究发现中剂量黄连素5 mg·kg⁻¹·d⁻¹干预可以显著改善海洛因成瘾小鼠学习记忆的损伤。这种作用可能与黄连素下调海马脑区神经元的因海洛因而致的异常增高的自噬水平有关。但是黄连素是如何下调神经元自噬水平的机制仍然未知，这将是未来研究的重点。

参考文献

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基金项目：贵州省中医药管理局项目（项目编号：QZYY-2021-039)和大学生创新创业训练计划项目(项目编号：202210660067)

作者简介：卢明杰，男，本科在读，主要从事神经疾病的机制研究：E-mail: mingjielu@yeah.net

*通讯作者：夏白娟，女，博士，教授，硕士研究生导师，主要从事药物成瘾机制的研究和相关疾病的药物治疗。