壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体的制备及应用研究

摘要：目的：制备壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）单克隆抗体，并验证其相关特性，确定是否可以作为壳多糖酶3样蛋白1试剂的原料。方法：本研究通过使用CHI3L1重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选和克隆化培养，运用间接 ELISA、Western blot、胶乳免疫比浊等方法对抗体进行鉴定。结果：本研究成功制备的3株CHI3L1单克隆抗体，经ELISA分析，抗体效价可达1：21600，经Western blot验证显示抗体特异性识别重组CHI3L1蛋白。结论：本研究制备CHI3L1单克隆抗体效价高、特异性强，可应用于胶乳免疫比浊法试剂的制备，为 CHI3L1 相关疾病的诊断与治疗研究提供了关键技术支持。

关键词：CHI3L1；单克隆抗体；重组抗原；纤维化诊断；ELISA；Western blot

1. 引言

壳多糖酶3样蛋白1（chitinase-3-like protein 1，CHI3L1）是糖基水解酶家族18的非经典成员，作为分泌型糖蛋白广泛表达于多种组织细胞[1]，在组织修复、炎症反应及纤维化进程中发挥重要作用。近年研究证实，CHI3L1在多种疾病中的异常表达与疾病进展密切相关。在慢性肝病（如乙肝、丙肝相关肝硬化）中，CHI3L1血浆浓度可升高10-50倍，且与肝纤维化分期呈显著正相关（r=0.78，p<0.001）[2,3]；在特发性肺纤维化（IPF）中，血清CHI3L1浓度较健康对照组升高8.3倍，是预测疾病进展的独立风险因子（HR=3.2, 95%CI 1.8-5.7）[4]。此外，CHI3L1在结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中也呈现高表达，与肿瘤侵袭性及不良预后相关[5,6]。

本研究通过使用高纯度CHI3L1重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，成功建立稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株[7-9]。经系统表征验证，该单抗具有优异的特异性和亲和力，并采用化学共价偶联方式成功建立高灵敏度胶乳免疫比浊检测方法，通过方法学比对试验，表明该抗体制备的检测方法与化学发光法具有良好的相关性，为CHI3L1检测试剂的进一步研究和评估提供技术支撑[10]。

2. 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

实验动物：SPF级BALB/c小鼠（6-8周龄，雌性，外购）。

细胞系：Sp2/0骨髓瘤细胞（实验室保存）。

重组抗原：纯度>95%的重组蛋白（外购）。

主要试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量试剂盒、羧基胶乳微球等。

仪器设备：二氧化碳培养箱）、超速离心机、多功能酶标仪、超声波细胞破碎仪、全自动生化分析仪。

2.2 单克隆抗体制备流程

2.2.1 动物免疫及效果检测方案

将重组 CHI3L1 蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，皮下注射免疫 BALB/c 小鼠，每只小鼠注射蛋白量为50μg。2 周后，用重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫，剂量同第一次。再过 2 周进行第三次免疫，免疫途径为腹腔注射，不加佐剂。第三次免疫后1周，尾静脉采血，分离血清，用ELISA 法检测血清抗体效价。当血清抗体效价达到 1:10000 以上时，进行加强免疫，加强免疫后 3 天，取小鼠脾脏细胞用于细胞融合。

2.2.2细胞融合

将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞按1:5的比例混合50 mL离心管中，1200 r/min离心10 min，弃上清。在37℃水浴中，缓慢加入50% PEG1500 1 mL，作用1 min后，缓慢加入10 mL预热的DMEM培养基终止融合。1200 r/min 离心 10 min，弃上清，用含 20% 胎牛血清的 HAT 培养基重悬细胞，接种于 96 孔细胞培养板，每孔 100μL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

2.2.3阳性克隆筛选与克隆化培养

融合后第7天，待杂交瘤细胞克隆生长至孔底面积的1/3 - 1/2 时，吸取培养上清，用间接 ELISA 法筛选阳性克隆。将阳性克隆通过有限稀释法进行3次克隆化培养，获得稳定分泌抗 CHI3L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.2.4单克隆抗体腹水的制备与纯化

2.2.4.1单克隆抗体腹水的制备

选取6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡，以刺激小鼠腹腔产生适宜杂交瘤细胞生长的微环境。将筛选出的杂交瘤细胞用EMEM培养培养基重悬后注射到小鼠腹腔内。细胞注射后密切观察小鼠状态，约7-14天，当小鼠腹部明显膨大，行动迟缓时，进行腹水收集，取出腹水后3000 rpm离心10 min，取上清液放于-80 ℃保存。

2.2.4.2单克隆抗体腹水的纯化

在搅拌条件下，向收集的腹水上清液中缓慢加入固体硫酸铵，使其饱和度达到 45%（约每100 mL 腹水加入27.7 g 硫酸铵），4℃搅拌1 h，静置过夜。次日，4℃、12000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀用适量 PBS（pH 7.4）溶解。将溶解后的溶液装入透析袋，于 PBS（pH 7.4）中 4℃透析过夜，期间更换透析液3-4 次，去除硫酸铵及小分子杂质。

2.2.5单克隆抗体的鉴定

2.2.5.1抗体效价的鉴定

将重组 CHI3L1 蛋白用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释至 1μg/mL，包被 96 孔酶标板，每孔100 μL，4℃过夜。次日，弃去包被液，用含0.05% Tween - 20 的 PBS（PBST）洗涤2次，每孔加200 μL 5% 脱脂奶粉，37℃封闭2 h。洗涤5次，加入三倍稀释法稀释的抗体，每100 μL，37℃孵育30min。再次洗涤5次，加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（1:5000 稀释），每孔100 μL，37℃孵育30min。最后洗涤5次，加入 TMB 底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应10min，加入2 M H2SO4终止反应，用酶标仪测定 OD450 值。以 OD450 值大于阴性对照 2.1 倍的最高稀释倍数作为抗体效价。

2.2.5.2 抗体特异性的鉴定

将重组 CHI3L1 蛋白进行SDS - PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至 PVDF 膜上。用5% 脱脂奶粉封闭1h后，加入杂交瘤细胞培养上清（1:10000 稀释），4℃孵育过夜。次日，用 PBST 洗涤3次，每次10 min，加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（1:5000 稀释），室温孵育 1 h。再次洗涤后，加入ECL化学发光试剂，在化学发光成像系统下观察结果。

2.2.5.3 抗体亚型的鉴定

采用间接 ELISA 的方法鉴定抗体亚型，将CHI3L1重组蛋白稀释至1 μg/ml，混匀后以100 μL/孔加入至酶标板中，4℃过夜；洗板2次，每孔加入100 μL小牛血清溶液，37℃孵育2h；洗板5次，将纯化后的抗体稀释10000倍，以100 μL/孔加入至酶标板中，37℃孵育30min；洗板5次，加入经过5000倍稀释的IgG1-HRP、IgG2a-HRP、IgG2b-HRP、IgG3-HRP、IgGM-HRP、GAM-HRP，37℃孵育30min；洗板5次后加入100 μL/孔TMB显色液，37℃孵育10min，每孔加入50μL2mol/L H2SO4终止反应，在酶标仪450nm下读取OD值。

2.2.6 抗体配对功能性试验

使用本研究筛选出的单克隆抗体，用胶乳免疫比浊法模式进行配对实验。将单克隆抗体通过化学共价结合的方式偶联到粒径为200nm的羧基胶乳微球上，制备成免疫胶乳试剂，然后两两进行混合搭配，使用全自动生化分析仪测定经梯度稀释的CHI3L1抗原。

2.2.7 抗体的性能确认

    使用2.2.6制备的胶乳试剂，对经CHI3L1化学发光法试剂测定的样本进行测定，样本例数为40例，范围覆盖15-1200ng/ml，计算相关性。

3. 结果

3.1杂交瘤细胞克隆化培养结果

从筛选出阳性克隆经3次有限稀释法克隆化培养，获得3株稳定分泌抗 CHI3L1 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为19B4、40D5 和22G8。

3.2小鼠单克隆抗体效价鉴定结果

图1 单克隆抗体效价分析结果

如图1所示，通过检测3株抗体效价，稀释至21600倍时，OD450nm大于1，其中40D5和22GB效价要高于19B4。

3.3 小鼠单克隆抗体特异性鉴定结果

对3株单克隆抗体进行纯化，采用SDS-PAGE 鉴定纯化结果，考马斯亮蓝染色，结果2如图所示，条带位置正确，且纯度达到了 90%以上。

图2 单克隆抗体电泳图(a-19B4、b-40D5 和c-22G8)

3.4 小鼠单克隆抗体亚型鉴定结果

    将纯化后的单克隆抗体用 ELISA 进行亚型测定。测定结果为融合后筛选出的3株抗体均为IgG1（图3）。

3.5小鼠单克隆抗体配对功能性试验

采用化学共价偶联方式，将筛选出3株单克隆抗体分别偶联到JSR200nm的羧基胶乳微球，制备成免疫胶乳试剂后两两进行混合，测定经梯度稀释的CHI3L1抗原。得出如下结果，见图3。从图中可分析出，40D5和22G8配对的单克隆抗体反应度最高，后续可使用该配对进行方法学的评价。

3.6 抗体的性能确认

用本研究的抗体制备的胶乳免疫比浊试剂对化学发光法测定的样本进行检测，检测结果显示，两个方法学相关性R2=0.9888，回归方程为Y=0.9438+5.0052。表明使用本研究抗体制备的试剂与化学发光法结果相关性良好。

4. 讨论与结论

本研究采用经典的杂交瘤技术，经过多次免疫、细胞融合、阳性克隆筛选和克隆化培养，获得了 3 株稳定分泌抗 CHI3L1 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对制备的单克隆抗体进行鉴定，结果表明这些抗体具有较高的效价和良好的特异性。通过间接 ELISA 法测定抗体效价，均达到 1:21600，说明该抗体与抗原的结合能力较强。Western blot 和免疫荧光实验结果均显示，这些抗体能够特异性识别 CHI3L1 蛋白，无论是在纯化的重组蛋白水平还是在细胞内蛋白水平，均表现出良好的特异性，这为后续研究 CHI3L1 在不同生物样本中的表达和功能提供了可靠的工具。

使用本研究的抗体制备的试剂盒体现出良好性能，与化学发光法结果具有显著相关，表明该抗体可以应用于胶乳免疫比浊试剂的制备，为抗体的临床应用奠定的技术基础。

然而，本研究仍存在一些不足之处。在细胞融合过程中，融合效率有待进一步提高，以获得更多的阳性克隆；在抗体的应用研究方面，仅进行了初步的鉴定，后续还需进一步探索这些抗体在疾病诊断和治疗中的应用潜力，如开发基于这些抗体的荧光免疫层析法检测试剂盒、化学发光法检测试剂等，并开展相关的临床研究。

5. 参考文献

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