野生荒漠肉苁蓉对家兔离体十二指肠平滑肌收缩活动影响

【摘要】目的：通过观察肉苁蓉水煎液及其主要活性成分松果菊苷和毛蕊花糖苷对家兔离体十二指肠平滑肌收缩活动的影响作用，分析其可能的作用机制。方法：取新西兰大白兔十二指肠段12组，每段长约2-3cm，放入含有37℃台式液的恒温灌流装置中，分别加入不同浓度的野生荒漠肉苁蓉水煎液、其主要活性成分及阻断剂，用BL-420F生物信息采集系统记录实验结果。结果：野生荒漠肉苁蓉可促进家兔离体十二指肠平滑肌收缩的幅度、降低收缩频率（P＜0.05），中剂量组的效应最强（P＜0.05），且与乙酰胆碱和Cacl2具有协同效应（P＜0.05）；主要活性成分松果菊苷比毛蕊花糖苷和中剂量水煎液对十二指肠活动的影响效应更强（P＜0.05）；维拉帕米和阿托品可不同程度的阻断肉苁蓉对十二指肠收缩的促进作用（P＜0.05）。结论：肉苁蓉对家兔离体十二指肠平滑肌收缩活动有促进作用，其活性成分松果菊苷可能发挥主导效应，作用机制可能与促进Ca2+内流和兴奋M受体有关。

【关键词】野生荒漠肉苁蓉；离体十二指肠；收缩活动

肉苁蓉为列当科植物管花肉苁蓉Cistanche salsa(G.A.Mey)G.Beck的干燥带鳞叶的肉质茎，主产于内蒙古、甘肃、新疆等地，素有“沙漠人参”的美誉，具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效[1]。主要活性成分为苯乙醇苷类、黄酮类、多糖类等，其中苯乙醇苷类有较强的药理活性，内蒙古产地样品中苯乙醇苷成分以松果菊苷和毛蕊花糖苷为主[2]。目前有关肉苁蓉通便作用的报道较多，本研究主要通过观察肉苁蓉及其主要活性成分松果菊苷和毛蕊花糖苷对家兔离体十二指肠活动的影响，并初步探讨其可能的作用机制，为肉苁蓉的推广使用提供相应的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

健康的新西兰大白兔（张掖市誉诚医药生物科技有限公司提供）14只，体重（1.5±0.5）kg，雌雄不限。实验前12小时禁食不禁水。BL-420F生物信息采集系统、张力传感器、恒温平滑肌灌流槽（以上仪器均由成都泰盟科技有限公司提供，型号分别为：B20-420F、FT-100）。新鲜的台式液和1%Cacl2的由本实验室配置，肉苁蓉由阿拉善右旗宏大农牧民专业合作社提供，毛蕊花糖苷和松果菊苷由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2方法

肉苁蓉水煎液的制备：称取50 g野生荒漠肉苁蓉饮片，加水过饮片500 ml，浸泡30 min，煎煮浓缩至300 ml，装瓶消毒，药渣加500 ml的水继续煎煮浓缩至250 ml，合并两次的药液，即得含生药91 mg/ml肉苁蓉水煎液。实验操作时分别取5.49 ml、10.99 ml、21.98 ml肉苁蓉煎液（91 mg/ml）置于50 ml的烧杯中，稀释成浓度分别为：10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml的肉苁蓉稀释液备用。毛蕊花糖苷和松果菊苷用生理盐水配置成浓度为10-5mol∕L备用。

十二指肠标本的制备：实验前动物禁食达12小时，自由饮水。木棒敲击头部致使其昏迷，快速沿腹正中线开腹，迅速取出十二指肠15 cm，分别剪成约2.0 cm-3.0 cm的肠段5段，迅速用温热的台式液将肠内容物洗净，置于37℃新鲜台氏液中备用[3]。

1.3实验分组

将肠段随机分到实验组和对照组中，①正常对照组：在含有10ml台式液的灌流槽中加入台式液0.1 ml；②阳性对照组：在含有10ml台式液的灌流槽中加入1:10000的乙酰胆碱0.1 ml；③肉苁蓉（低、中、高浓度）水煎液组：分别加入10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml肉苁蓉水煎液0.1 ml；④乙酰胆碱+中浓度肉苁蓉组：操作同上；⑤CaCl2（10-5mol∕L）+中浓度肉苁蓉组：操作同前。⑥毛蕊花糖苷（10-5mol∕L）组：操作同上；⑦松果菊苷（10-5mol∕L）组：操作同上；⑧毛蕊花糖苷+松果菊苷组：操作同上；⑨维拉帕米+中浓度肉苁蓉组：操作同上；⑩阿托品+中浓度肉苁蓉组：操作同上。每次加完药液2min后记录收缩曲线变化。

十二指肠收缩正常收缩活动的记录：将清洗干净的肠管两端用细线固定，一端连于张力换能器上，另一端连接在灌流装置的通气管钩上，轻放于盛有10 ml台式液，并通有95%O2和5%CO2的灌流管中，灌流管的温度保持在(37±0.5)℃。继续冲洗两段2-3遍，直至灌流液清亮透明，待其收缩曲线基本稳定后，调节相关参数及定标，使基线稳定在0g水平，记录正常生理状态下的收缩张力曲线和数据作为对照。

1.4统计学方法

用SPSS24.0对数据进行单因素方差分析，以（x±s）表示，P＜0.05表明差异有统计学意义。

2结果

2.1  十二指肠平滑肌正常收缩活动

十二指肠段能在37℃台式液中自发产生节律性的收缩活动。与正常组相比，乙酰胆碱能增加十二指肠收缩张力和频率（P＜0.05）。（见图1，见图2，表1）。

2.2肉苁蓉及其活性成分对十二指肠平滑肌收缩活动的影响

与正常组相比较，10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml的肉苁蓉水煎液均能明显增加十二指肠收缩的最大、最小张力和平均张力（P＜0.05），降低收缩频率（P＜0.05）；药物组间相比，中剂量组肉苁蓉水煎液对十二指肠收缩活动的影响效应最强（P＜0.05）；主要活性成分松果菊苷对十二指肠收缩活动的兴奋效应强于毛蕊花糖苷和中剂量水煎液（P＜0.05）；松果菊苷和毛蕊花糖苷有协同效应（P＜0.05）。（见图3-8，表1）。

2.3钙离子与中剂量肉苁蓉对家兔离体十二指肠收缩活动的影响

与正常组相比较，氯化钙能显著增强十二指肠的收缩活动，在此基础上加入中剂量肉苁蓉水煎液，收缩活动强于氯化钙的效应（P＜0.05）；维拉帕米与中剂量肉苁蓉水煎液共同加入灌流液中，维拉帕米可明显阻断肉苁蓉的效应（P＜0.05）。（见图1，9，10，11，表2）。

2.4中剂量肉苁蓉水煎液分别与Ach和阿托品对十二指肠收缩活动的影响

分别与乙酰胆碱和中剂量肉苁蓉水煎液组相比，乙酰胆碱+中剂量肉苁蓉水煎液明显增强十二指肠的收缩张力（P＜0.05）；阿托品可阻断肉苁蓉对十二指肠收缩张力的兴奋效应（P＜0.05），对收缩频率无阻断作用（P＞0.05）。（见图12-14，表1）

表 1  肉苁蓉对家兔离体十二指肠活动的影响（n=12，x ±s ）

注：与正常组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与肉苁蓉中剂量组比，ΔP＜0.05；与毛蕊花糖苷相比，★P＜0.01

表2  肉苁蓉对家兔离体十二指肠活动的影响（n=12，x±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与肉苁蓉中剂量组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

表3  钙离子与中剂量肉苁蓉对家兔离体十二指肠活动的影响（n=12，x±s）

注：与正常组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 ；与肉苁蓉中剂量组比较，ΔP ＜ 0.05，ΔΔP ＜ 0.01,

4讨论

十二指肠活动受体液和神经因素的影响，当外源性药物、神经递质与膜受体结合时，会引起肌细胞信号转导通路改变，从而调节其运动[4]。王聪等[5]认为，存在于十二指肠壁的肌间神经丛通过释放兴奋性神经递质，如乙酰胆碱、P物质等可促进十二指肠运动。Ach与平滑肌细胞膜上M受体结合，通过激活AC-cAMP-PK A信号通路对十二指肠活动发挥促进作用[6]。肉苁蓉有“润肠通便”的作用，其作用比较缓和，对治疗产妇、老年人和身体虚弱等人群有很好的效果[7]。阿托品为胆碱能受体阻断剂，可阻断Ach的M样作用。本实验结果显示，阿托品可阻断肉苁蓉水煎液对家兔离体十二指肠平滑肌收缩活动的促进效应，而Ach对肉苁蓉这一影响作用会产生协调效应。由此可见，肉苁蓉促进离体十二指肠收缩活动的作用与M受体有关，其是否与激活AC- cAMP-PK A信号通路有关，还需进一步研究。

据《中华人民共和国药典》记载，肉苁蓉的质量控制成分为通过高效液相法测定松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量[1]。毛蕊花糖苷是多种药用植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗癌及神经保护作用[8]。刘艳文等[9]研究发现毛蕊花糖苷通过抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路表达，抑制炎症和氧化应激反应。李博等[10]研究发现毛蕊花糖苷通过抑制了JNK和ERK的磷酸化，阻滞JNK∕ERK通路的激活，抑制RANKL诱导破骨细胞生成，改善CIA小鼠的骨侵蚀。由此可见，关于毛蕊花糖苷的作用更多倾向于其抗炎、抗氧化方面，有关对肠道平滑肌收缩活动的影响作用的研究，目前尚未见报道。本实验发现，毛蕊花糖苷对十二指肠收缩活动有促进作用，但其效应与水煎液各组相比差异无统计学意义，但弱于松果菊苷的兴奋效应。Lin J等[11]研究发现毛蕊花糖苷可增强中枢胆碱能系统的功能，郭锦华等研究发现毛蕊花糖苷可降低慢性心力衰竭大鼠交感神经的兴奋性[12]。Young-Ji shiao等[13]研究结果显示，松果菊苷可通过抑制胆碱酯酶对乙酰胆碱的降解作用，恢复乙酰胆碱的活性来改善大鼠认知功能障碍。段晓宇等[14]研究发现松果菊苷发挥润肠通便作用与其增加肠动力和肠道水液有关。本实验结果显示，松果菊苷对十二指肠收缩活动的兴奋效应强于毛蕊花糖苷和水煎液各组，且与毛蕊花糖苷有协同效应。研究表明肉苁蓉中的多糖类能促进谷氨酸、去甲肾上腺素等物质的分泌[15]，二者对小肠平滑肌的收缩活动均有抑制作用。由此可见，肉苁蓉对小肠平滑肌收缩活动的兴奋作用主要与松果菊苷有关。

平滑肌细胞胞质中Ca2+浓度的调控存在电-机械耦联和药物-机械耦联两条途径，电-机械耦联途径主要是促使胞外Ca2+内流，药物-机械耦联途径主要是通过激活G蛋白耦联受体-PLC-IP3通路，促使肌质网中Ca2+释放，升高胞内Ca2+浓度，Ca2+主要通过与钙调蛋白结合，激活肌球蛋白轻链激酶（GASR）而产生收缩活动[16]。王煜姣[17]对功能性消化不良大鼠促胃动力研究发现，药物对胃肠动力的增加效应与对GASR-PLC

-IP3-Ca2+信号通路的影响有关。维拉帕米属于L型钙通道阻滞剂，本实验结果显示，维拉帕米可明显阻断肉苁蓉对家兔离体十二指肠平滑肌收缩的促进作用，通过代价氯化钙溶液增加细胞外液中Ca2+浓度后，十二指肠平滑肌的最大、最小收缩张力和收缩评率均明显增加，这与以上研究一致；同时发现肉苁蓉能增强氯化钙对十二指肠平滑肌收缩活动的促进作用。由此可见，肉苁蓉可通过电-机械耦联途径促使胞外Ca2+内流，从而增强小肠平滑肌的收缩张力和频率，但是否通过激活药物-机械耦联途径中G蛋白耦联受体-PLC-IP3信号通路，促进肌质网中Ca2+释放进入胞内而升高胞质中Ca2+浓度，还有待于进一步研究。

综上所述，肉苁蓉对离体十二指肠平滑肌收缩活动具有较强的促进作用，其中苯乙醇苷类中的主要活性成分松果菊苷发挥主导作用，其机制与兴奋小肠平滑肌细胞膜上的M受体和促进胞外Ca2+内流有关。

参考文献

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基金项目：甘肃省科技计划项目（编号：22JR11RG224）；甘肃省大学生创新创业训练计划项目（编号：S202210740146）。

作者简介：王荣德（1974.10-），男，汉族，甘肃张掖人，本科，副教授，研究方向：生理学。