两种医院制剂微生物限度检查方法验证

[摘要]目的：对两种优化后的医院制剂微生物限度检查进行方法验证。方法：根据《中国药典》2020年版（四部）通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106控制菌检查法进行方法验证。结果：采用优选出的方法进行微生物限度检查验证试验时，微生物计数测定中，试验组所加的5种试验菌回收比值均在 0.5～2.0 限度内；控制菌检查，试验组均能检出所加试验菌相应的反应特征。结论：通过方法验证建立两种医院制剂的微生物限度检查方法，鱼肝油软膏采用常规平皿法,鼻软膏采用中和平皿法，其结果符合药典规定。

关键词：微生物限度，方法验证，制剂

Validation of Microbial Limit Test Methods of Two Hospital Preparations

XU Ying

（ Department of Pharmacy Liuzhou People,s Hospital,Liuzhou 545006,China）

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To establish a method for the microbial limit test of two hospital preparations. METHODS: The method was verified according to General Rule 1105 of the Four- part of the 2020 edition of Chinese Pharmacopoeia for microbial limit test of non-sterile products: microbial count method and 1106 control bacteria test method.RESULTS: When the microbial limit test was carried out with the preferred method, the recovery ratio of 5 kinds of test bacteria added in the test group was within the limit of 0.5 ~ 2.0. During the control bacteria examination, the corresponding reaction characteristics of the tested bacteria could be detected in all the experimental groups. CONCLUSION: The microbiological limit test methods of two hospital preparations were established through method verification. Cod liver oil ointment was used by conventional plate method, and nasal ointment was used by neutralizational process. The results were in line with pharmacopoeia.

 Key words: microbial limit, methodological validation，preparation

药品的微生物限度检查是药品安全性检验的重要指标之一，2020年版《中国药典》（四部）中提到建立药品的微生物限度检查法所选方法的适用性须经确认。为此课题组参照《中国药典》2020年版（四部）通则1105、1106非无菌产品微生物限度检查、控制菌检查法中的标准[1]，对两种复方油脂类医院制剂鼻软膏（含磺胺嘧啶、硼酸，辅料为樟脑、薄荷油、液状石蜡油、白凡士林）、鱼肝油软膏（含鱼肝油，辅料为白凡士林）的微生物限度检查方法进行优化，将较为复杂的乳化剂（5g司盘80、3g单硬脂酸甘油脂、10g聚山梨脂80）优化为十四烷酸异丙酯作为乳化剂，并进行了方法适用性验证试验，优选出适宜该两种制剂的微生物限度检查方法，确保了验证结果的可靠性及操作的简便性。

1 仪器、材料

1.1仪器

压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂）、霉菌培养箱（MJ-250-I型，上海一恒科技有限公司）、隔水式恒温培养箱（9160型，海一恒科技有限公司）、干燥箱（101-2型，中华人民共和国上海市实验仪器总厂）电热恒温水温箱（S648，上海医疗器械七厂）。

1.2样品

鼻软膏、鱼肝油软膏两种试验样品均为本院制剂室生产，每种制剂品种均取样 3个批号，每个批号取2个最小包装。

1.3试验菌株

铜绿假单胞菌181108、金黄色葡萄球菌 181025、枯草芽孢杆菌181110、黑曲霉菌181102、白色念珠菌181026、大肠埃希菌 181107。以上试验菌株含量范围500～1000cfu/颗，传代次数为4代，生产单位均为北京三药科技开发公司。

1.4培养基、稀释液及试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基，以上培养基生产单位均为广东环凯微生物科技有限公司；0.9%氯化钠溶液（四川拜伦药业股份有限公司）；十四烷酸异丙酯（广东环凯微生物科技有限公司）。

2方法

参照2020年版《中国药典》（四部）通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106控制菌检查法进行验证试验。两种制剂分别进行3次独立的平行试验，分别计算各次试验的回收比值。

2.1菌液制备

按菌株产品使用说明书：临用前用复溶液制备成每1 mL含菌数为50-100cfu的菌悬液和孢子菌液。

2.2供试液制备

鱼肝油软膏5g加乳化剂无菌十四烷酸异丙酯5ml，缓慢加入45℃的无菌氯化钠溶液至100ml，边加边搅拌，使充分乳化，得1：20供试液；鼻软膏10g加乳化剂无菌十四烷酸异丙酯10ml，加入中和剂无菌1%对氨基苯甲酸溶液10ml[2]，缓慢加入45℃的无菌氯化钠溶液至100ml，边加边搅拌，使充分乳化，得1：10供试液。乳化剂和稀释剂已做对照组试验。

2.3验证试验

2.3.1需氧菌总数计数方法适用性试验：均采用平皿法，依法[1]进行3组试验，①试验组：取2.2项下制备的供试液 1mL和2.1项下制备的菌液，分别注入平皿中，倾入胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定菌数；②菌液组：取2.1项下制备的菌液，方法同①；③供试品对照组：取2.2项下制备的供试液，方法同①。

2.3.2霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验：均采用平皿法，依法[1]进行3组试验，①试验组：取2.2项下制备的供试液 1mL和2.1项下制备的菌液，分别注入平皿中，倾入沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定菌数；②菌液组：取2.1项下制备的菌液，方法同①；③供试品对照组：取2.2项下制备的供试液，方法同①。

2.3.3计算公式：（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数计算回收比值。

2.3.4控制菌检查法适用性试验：依法[1]同时进行两组试验，试验组：取2.2项下制备的供试液10mL和 2.1项下制备的菌液加入增菌培养基中，根据相应控制菌检查法检查，应检出试验菌；阴性对照组不得检出试验菌。鱼肝油软膏不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌；鼻软膏不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、大肠埃希菌。

3 结果

3.1计数方法适用性试验结果

3.1.1需氧菌验证回收比值

两种医院制剂的需氧菌验证回收比值结果见表1。由表1实验数据可知：需氧菌回收比值在0.5～2之间，符合药典规定。

表 1 需氧菌验证回收比值

3.1.2霉菌和酵母菌验证回收比值

两种医院制剂霉菌和酵母菌回收比值见表2。由表2实验数据可知：霉菌和酵母菌回收比值在0.5～2范围内，符合药典规定。

表 2 霉菌和酵母菌验证回收比值

3.2控制菌检查法适用性试验结果

两种医院制剂控制菌检查验证结果见表3。由表中实验数据可知，阳性对照均检出控制菌，阴性对照组均未检出控制菌，两种医院制剂的试验组均检出了相应的控制菌。

表3 控制菌检查验证结果

注：“+”代表控制菌被检出，“-”代表控制菌未被检出，“/”代表无需检测

4讨论

根据3.1计数方法适用性试验结果得知，需氧菌、霉菌和酵母菌回收比值均在药典规定的0.5～2的范围内，3.2控制菌检查法适用性试验结果显示控制菌均能按照药典方法检出。本课题组将两种复方油脂类医院制剂微生物限度检查方法进行优化，将原来较为复杂的乳化剂（5g司盘80、3g单硬脂酸甘油脂、10g聚山梨脂80）优化为单一的十四烷酸异丙酯作为乳化剂，优选出适宜该两种制剂的微生物限度检查方法，鱼肝油软膏采用常规平皿法,鼻软膏采用1%对氨基苯甲酸溶液中和平皿法，通过方法验证实验从而保证结果的准确性和可靠性。

参考文献：

[1]  国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].2020年版.北京：中国医药科技出版社，2020：通则1105-1107.

[2] 韦曦，邱双成，王翠荣.29种医院制剂微生物限度检查方法验证[J].中国药房，2008，19（1）：52-54.

基金项目：广西壮族自治区卫生健康委员会科研课题（合同编号Z20200277）

作者简介：许盈，硕士研究生，副主任药师。研究方向：医院药学，药品检验。E-mail：34654561@qq.com