补肾强身胶囊微生物限度检查方法的探讨

摘要 目的：探讨补肾强身胶囊微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2020年版四部通则1105、1106的指导原则，对补肾强身胶囊采用增加 1∶50 稀释液法开展需氧菌总数方法适用性试验，利用 1：10 平皿法对霉菌和酵母菌总数计数方法进行适用性检测，结果：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检测，显示实验组和阳性菌对照组的回收率均在0.5-2.0之间，可有效去除补肾强身胶囊的抑菌作用。在常规法进行控制菌检查方法适用性试验中，试验组和阳性对照组均检出了阳性菌，也就是说，此方法可用于检查补肾强身胶囊微生物限度。结论：对补肾强身胶囊进行微生物限度检查方法验证，以确保药品中污染的微生物能被真实检出，为补肾强身胶囊的质量稳定提供了切实有效的保证和科学依据。

关键词：补肾强身胶囊；微生物限度检查；方法探讨

补肾强身胶囊为中药成方制剂，收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第四册》。是属于中成药类非处方药物，其作用主要用于肾虚精亏、肾府失养所引起的疲乏无力、腰膝酸软、失眠多梦、心悸、耳鸣耳聋等症状的治疗。补肾强身胶囊是复方制剂，药物组成包括淫羊藿、菟丝子、金樱子、女贞子和狗脊等。[1]根据补肾强身胶囊给药途径和处方，应进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌数的测定以及控制菌（耐胆盐革兰阴性菌 、大肠埃希菌、沙门菌）的微生物限度检查。

1 试验仪器、材料与方法

1.1 试验仪器

BSC-1360IIA2生物安全柜（北京东联哈尔），IC812C电热恒温培养箱（雅马拓），IN612C低温恒温培养箱（雅马拓）SQ510C立式高压蒸汽灭菌器（雅马拓），JY20002分析天平（上海良平）。

1.2 试验材料

1.2.1 培养基、稀释剂    pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基、肠道增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、RV沙门增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 。均购于北京陆桥技术有限责任公司，以上培养基均通过了适用性和灵敏度检查。

1.2.2 菌种   白色念珠菌[CMCC(F)98001]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、 乙型副伤寒沙门菌［CMCC( B) 50094］，均为不超过5代的药典规定的试验菌株且购自中国食品药品检定研究院。

1.2.3 样品 补肾强身胶囊

1.3 方法

1.3.1 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定方法的验证

1.3.1.1 菌液的制备

按照《中国药典》2020年版(四部)通则1105、1106项下方法制备菌液[2]。

1.3.1.2 供试液的制备

取补肾强身胶囊样品10g，加入100mLTSB中，振荡混匀，制成1∶10的供试液。取 1∶ 10供试液2 ml，加入TSB 8 ml中，振荡混匀，得到 1∶50 供试液。[3]

1.3.1.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

（1）试验组

取供试液 9.9 mL，每批5份，每份加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌及黑曲霉菌的菌液0.1mL，[4]使供试液每1mL含菌量不大于100 CFU。充分混匀，吸取各染菌供试液1mL，分别注入平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每份平行制备2个平板，33.0℃ 培养3d，测定需氧菌总数。取供试液9.9 mL，每批2份，每份加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌液0.1 mL，使供试液每1mL含菌量不大于100 CFU。充分混匀，吸取各染菌供试液 1mL注入平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每份平行制备2个平板，23.0℃ 培养5d，测定霉菌及酵母菌总数。

（2）阳性菌对照组：用TSB代替供试液，同试验组操作。

（3）供试品对照组：取“1.3.1.2”项下的 1 ∶10 供试液 1 ml，注入平皿中，立即倾注培养基，测定样品中的菌落数。（4）稀释剂组：取“1.3.1.2”项下的 1∶ 50供试液 1 ml，注入平皿中，立即倾注培养基，测定样品中的菌落数。

应进行阴性空白对照试验，用于监测试验过程中是否引入二次污染、试验条件是否满足药典要求，确保选定的方法具有良好的系统适用性，从而保证检验结果的准确性。[5]

根据《中国药典》 2020 年版四部通则 1105 规定，若回收率比值在 0． 5 ～ 2 范围内，可认为该供试品的制备方法和计数方法适用于该样品的菌落计数。

1.3.2 控制菌检查方法的验证

根据2020版药典四部通则1107规定，非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准表2中不得检出大肠埃希菌(1g)、不得检出沙门菌（10g）、耐胆盐革兰氏阴性菌应小于102cfu（1g）。

1.3.2.1 耐胆盐革兰阴性菌

（1）试验组：取1:10供试液10ml两份，分别加入规定量大肠埃希菌和铜绿假单胞菌（均不大于100cfu），23.0℃培养2小时。取经预培养2小时的供试液用肠道菌增菌液体培养基10倍稀释至1:100和1:1000的供试液，取上述3个稀释级的供试液各1ml分别接种至10ml肠道菌增菌液体培养基中，33.0℃培养24小时。

（2）阳性菌对照组：取胰酪大豆胨液体培养基10ml两份，分别加入规定量大肠埃希菌和铜绿假单胞菌（均不大于100cfu），同实验组稀释培养。

（3）阴性对照：使用10 ml 稀释液代替供试液同法操作。

分别取试验菌的实验组、阳性菌对照组、阴性对照培养物，分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，33.0℃培养18小时。阳性对照组接种大肠埃希菌的紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长；接种铜绿假单胞菌的紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长。试验组上菌落形态与阳性对照组一致。

（4）实验结果：阳性对照组检出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌；试验组检出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。方法适用性试验结果符合要求。

1.3.2.2 大肠埃希菌

（1）试验组：取1:10的供试液10ml和不大于100cfu大肠埃希菌悬液，加入100mlTSB中，33.0℃培养18小时。

（2）阳性菌对照组：取规定量大肠埃希菌悬液（不大于100cfu），加入100mlTSB中，33.0℃培养18小时。

（3）阴性对照：使用10 ml 稀释液代替供试液同法操作。

取试验组和阳性菌对照组、阴性对照培养物各1ml分别接种至100ml麦康凯液体培养基中，42.0℃培养24小时，取上述培养物分别划线于麦康凯琼脂培养基平板上，33.0℃培养18小时，在阳性菌对照组平板上菌落形态为鲜桃红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。实验组平板上菌落形态与阳性对照组一致。

（4）实验结果：阳性菌对照组检出大肠埃希菌，试验组检出大肠埃希菌，方法适用性试验结果符合要求。

1.3.2. 3沙门菌

（1）试验组：取本品10g和规定量沙门菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，33.0℃培养18小时。

（2）阳性菌对照组：取规定量沙门菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，33.0℃培养18小时。

（3）阴性对照：使用10 ml 稀释液代替供试液同法操作。

（4）取试验组和阳性菌对照组、阴性对照培养物各0.1ml，接种至10mlRV沙门菌增菌液体培养基中，33.0℃培养18小时后，取少量RV沙门菌增菌液体培养基培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基上，33.0℃培养18小时，阳性菌对照组平板上菌落形态为淡红色、半透明、中心无黑色（部分有黑色）。试验组平板上菌落形态与阳性菌对照组一致。

（5）实验结果：试验组检出沙门菌；阳性菌对照组检出沙门菌。方法适用性试验结果符合要求。

三批试验的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检测的回收比值见表 1，控制菌的方法学适用性试验结果如表 2 － 4 所示。

2 结果

表1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数方法学适用性试验结果

表2耐胆盐革兰阴性菌方法学适用性试验结果

表3大肠埃希菌试验结果

表4 沙门菌方法学适用性试验结果

3 补肾强身胶囊微生物限度检查结果及分析

根据《中国药典》 2020 年版四部通则 1105 规定，3批次样品回收率比值均在 0． 5 ～ 2 范围内，可认为该供试品的制备方法和计数方法适用于该样品的菌落计数。控制菌试验组均检出试验菌，阴性对照无菌生长。

4讨论

依照《中华人民共和国药典》2020 年版四部的规定：在微生物限度检查时，需要判断供试品对试验菌种是否有抗菌活性，如有则要选择合适的方法先消除或中和其抗菌活性再进行检查，以保证方法的适用性。[7]结果显示，批号为230104的补肾强身胶囊对细菌具有一定的抑制作用，1:10供试液枯草芽孢杆菌的回收率比值低于0.5，采用稀释法1∶ 50 供试液可基本消除抑菌性。采用三个厂家的样品进行重复试验，保证了检查方法的科学有效。由于中药口服制剂的中药材来源和生产工艺的特殊性，其被微生物污染的风险较大，药品检验是保障药品质量和安全性的重要关卡，药品微生物限度检查是保证用药的有效性、保障药品安全性的重要措施[8]。针对补肾强身胶囊微生物限度检查的试验方法，精准消除一些干扰因素，使操作简捷，结果精确，提高药品的检测质量，为相似药品微生物限度检查方法适用性试验提供参考。通过微生物限度检查，严格控制药品的质量安全，从根源上避免污染的情况，确保药品的疗效和用药安全。

参考文献

[1]周嵩煜‚ 宋嵩文‚ 庞云娟， 补肾强身胶囊微生物限度检查方法的探讨[J]中成药2009，31（8）1306-1308 .

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国国药典. 四部［M］. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 160-170

[3]解 慧，郭福庆，补肾强身片微生物限度检查方法研究及质量分析 [J]

天津药学 2018，30 （1）14-19.

[4] 中国食品药品检定研究院.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社,2019:444-447.

[5]任颖慧,曹鲁娜,赵蕊蕊,等. 药品微生物限度检查方法适用性中存在的问题及改进建议[J]. 中国药物经济学,2022,17(6):124-128.  

[6]梁 艳，李 卓，刘 荔.泌尿宁胶囊微生物限度检查方法学适用性 [J].工 业 微 生 物 ,2023 , 53 ( 4 ) 134-136.

[7]刘 荔, 李 岩, 俞树花, 朱建宁.宣肺止嗽合剂微生物限度检查方法的建立研究 [J].中国医药科学,2023,13(3).63-66.

[8]胡昌勤.药品微生物控制体系建设现状与展望[J].中国现代应用药学,2021,38(5):513-519.