青霉素钠无菌检验方法验证探究

摘要：青霉素钠属于β-内酰胺类抗生素(β-lactams)，具有抑菌性，青霉素钠无菌检查时可采用薄膜过滤法消除抑菌性。药典明确规定供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量一般不超过500ml，最高不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。青霉素抑菌性较强，过滤的液体量较大易损伤微生物，从而影响其生长。采用添加中和剂酶和薄膜过滤法相结合的方法进行验证，既可控制冲洗液用量，也不会影响微生物生长。结论：通过方法验证，证明该检测方法可适用于青霉素钠的无菌检查。

关键词：抑菌性；中和剂；无菌检验方法；薄膜过滤法

1 实验前准备
1.1设备、试样的准备

在开展青霉素钠无菌检验前，企业应提前准备仪器，如集菌培养器DGB330、脉动真空灭菌器、生化培养箱、HTY-K型培养器皿、生物安全柜等。检测过程保证仪器处于正常备用的状态，以免仪器使用过程中出现问题而影响实验结果。本次实验采用的中和剂为青霉素酶和头孢菌素酶。

1.2环境的要求
检测环境的要求也非常严格，整个实验过程要在经设备确认合格的无菌超净层流下进行。实验操作用层流台面，全程培养器皿进行环境监测跟踪，确保检测环境受控无菌。

1.3实验菌液的制备
验证无菌检验方法期间，本次实验所用的菌株进行严格要求。实验所选菌株类型下述：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉。针对上述菌种的制备，具体方法下述：

（1）金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌新鲜培养物少许，接种至胰酪大豆胨液体培养基中，置30-35℃培养18-24h。分别取上述培养液1mL，加无菌氯化钠溶液（9mL；0.9%）。

（2）取生孢梭菌新鲜培养物少许，接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，置30-35℃培养18-24h，吸取培养液1mL，加无菌氯化钠溶液（9mL；0.9%）。

（3）取白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物少许，接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，置20-25℃培养24-48h。吸取培养液1mL，加无菌氯化钠溶液（9mL；0.9%）。

（4）取枯草芽孢杆菌胰酪胨大豆琼脂培养基斜面，加入0.9%无菌氯化钠溶液洗下芽孢制成悬液，吸取1mL，加无菌氯化钠溶液（9mL；0.9%）。

（5）取经20-25℃培养7d的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入3-5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子制成孢子悬液，吸取1mL菌液加9mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。

（6）上述菌液10倍递增稀释至菌落数＜100cfu/mL用于检查。分别取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌（菌落数＜100cfu/mL）菌液1mL，加入胰酪胨大豆琼脂培养基，每种菌液平行制备2皿，生孢梭菌菌液，加入硫乙醇酸盐流体培养基管中，平行制备2管，置30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌、黑曲霉菌液（菌落数＜100cfu/mL）1mL，加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2皿，置20-25℃培养48~72h，活菌计数。

2、适用性检查

2.1中和剂毒性试验
 为判定中和剂对菌落生长有无抑制作用，故需开展中和剂青霉素酶、头孢菌素酶的毒性试验。将青霉素酶或头孢菌素酶制成＞300万U/mL，选取符合要求稀释级别（菌落数＜100cfu/mL）的试验菌用于验证。其中① 试验组：取3支含50mL硫乙醇酸盐流体培养基试管，每支试管中各加入含300万U青霉素酶或头孢菌素酶的溶液，再分别加入1mL金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌菌液；取3支含50mL胰酪大豆胨液体培养基试管，每支试管中各加入含300万U青霉素酶或头孢菌素酶的溶液，再分别加入1mL枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液。同法操作，每种培养基各取1管，分别加入含300万U青霉素酶或头孢菌素酶的溶液，不加试验菌作空白对照。② 阳性对照：同上述试验组操作，不加青霉素酶或头孢菌素酶，硫乙醇酸盐流体培养基置30-35℃培养72h，胰酪大豆胨液体培养基置20-25℃培养72h。结果判定：与阳性对照比较，72h内试验组各管试验菌均生长良好，则判定青霉素酶或头孢菌素酶300万U用量对试验菌不产生毒性，＜300万U青霉素酶或头孢菌素酶，可实施验证。

2.2供试品试验组适用性检查
为考察中和剂对供试品检测过程是否存在干扰及抑制，故需开展供试品试

验组适用性检查。

2.2.1中和剂酶适用性检查

安装DGB330集菌培养器，每个集菌培养器用50ml的0.1%无菌蛋白胨溶

液润湿滤膜。供试品制备：取供试品18瓶（1g/瓶），分2次试验，每9瓶供试品用300ml 0.9%无菌氯化钠溶液溶解，合并制成供试液。将全部供试液导入集菌培养器（每套集菌培养器为3个培养器，一次试验使用2套集菌培养器），滤过后每个培养器各导入含100万单位青霉素酶或含100万单位头孢菌素酶的0.1%无菌蛋白胨溶液中和（青霉素酶稀释：取1瓶青霉素酶共600万单位加入500ml00.1%无菌蛋白胨溶液，取250ml上膜，分3个滤筒；头孢菌素酶稀释：取2瓶头孢菌素酶共400万单位加入400ml0.1%无菌蛋白胨溶液溶解，取300ml上膜，分3个滤筒），滤过后每个滤筒各导入0.1%无菌蛋白胨溶液100ml，分别加入经计数过的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml，混匀后滤过。

两种不同中和剂的培养条件：其中含金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌的培养器中各导入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，含枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的培养器中各导入100ml胰酪大豆胨液体培养基；含金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌的集菌培养器置30~35℃培养5天，含枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的集菌培养器置20~25℃培养5天。

2.3阳性对照组

 取DGB330集菌培养器2套，用50ml0.1%无菌蛋白胨溶液润湿滤膜，各导入含100万单位青霉素酶或含100万单位头孢菌素酶的0.1%无菌蛋白胨溶液，滤过后导入100ml0.1%无菌蛋白胨溶液，加入经计数过的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各1ml菌液（菌落数小于100cfu/ml），混匀后滤过；在含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌培养器中各导入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，置30~35℃培养5天；在含枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉培养器中各导入100ml胰酪大豆胨液体培养基，置20~25℃培养5天；观察并记录结果。

2.4 阴性对照组
取DGB220集菌培养器1套，2个培养器各用50ml0.1%无菌蛋白胨溶液润湿滤膜，再分别导入含100万单位青霉素酶或含100万单位头孢菌素酶的0.1%无菌蛋白胨溶液，滤过后分别导入100ml硫乙醇酸盐流体培养基和100ml胰酪大豆胨液体培养基，不加对照菌液，分别置30~35℃、20~25℃各培养5天，观察并记录结果。
2.5供试品日常无菌检查

取青霉素钠9瓶（1g/瓶），用300ml 0.9%无菌氯化钠溶液溶解，合并制成供试液。将全部供试液导入集菌培养器，采用薄膜过滤法，滤过，每个培养器各导入含100万单位青霉素酶或含100万单位头孢菌素酶的0.1%无菌蛋白胨溶液中和，用0.1%无菌蛋白胨溶液冲洗滤膜，冲洗量为300ml，每个培养器100ml，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，进行无菌检查。培养14天应无菌生长。

3实验结果分析
实验结果显示：中和剂采用青霉素酶、头孢菌素酶分别进行试验，5天内，与阳性对照组比较，供试品试验组各试验菌均生长良好。阳性对照组采用青霉素酶、头孢菌素酶分别进行试验，阳性对照组各试验菌均生长良好。阴性对照组采用青霉素酶、头孢菌素酶分别进行试验，均无菌生长。经过验证，将中和剂酶及薄膜过滤法有效结合，可避免假阴性、假阳性发生，检测结果有效。

4结束语
药品生产企业为进一步提高药品生产质量，减少质量安全问题发生，应规范生产人员日常行为规范，加强药品质量检测过程控制，保证人们用药安全。本次实验既控制供试品的抑菌性，又能确保微生物的有效生长，防止实验期间出现假阴性、假阳性的情况。

参考文献

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